DB34/T 5406-2026 棘胸蛙

　　ICS 65.150 CCS B 52

　　34

　　安 徽 省 地 方 标 准

　　DB34/T 5406—2026

　　棘胸蛙

　　Chinese spiny frog

　　2026 - 01 - 05 发布 2026 - 02 - 05 实施

　　安徽省市场监督管理局 发 布

　　DB34/T 5406—2026

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由安徽农业大学提出。

　　本文件由安徽省农业农村厅归口。

　　本文件起草单位：安徽农业大学、宁国市民鸿农业科技有限公司、宁国市金鼎家庭农场、池州市贵池区人民政府江口街道办事处、泾县畜牧兽医水产服务中心(泾县动物卫生监督所)、芜湖市渔业管理服务中心、庐江县龙桥镇人民政府农业农村工作办公室。

　　本文件主要起草人：苏时萍、常芹芹、刘鑫、吴谢强、秦迎春、左爱民、汪百才、曲春娟、侯文琦、李西雷、万志程、陈啸、宋彩霞、张自成、唐珂嘉。

　　棘胸蛙

　　1 范围

　　本文件确立了棘胸蛙(Quasipaa spinosa，David, 1875)的学名与分类，规定了棘胸蛙种质鉴定的主要形态构造特征、生长与繁殖、细胞遗传学和生化遗传学特性， 描述了相应的检测方法，规定了判定规则。

　　本文件适用于棘胸蛙的种质检测与鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分:抽样方法

　　GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分:繁殖性能的测定

　　GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分:染色体组型分析

　　GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第14部分:DNA含量的测定

　　GB/T 25884 蛙类形态性状测定

　　GB/T 45060 黑斑侧褶蛙

　　3 术语和定义

　　GB/T 25884 和 GB/T 45060 界定的术语和定义适用于本文件。

　　4 学名和分类

　　4. 1 学名

　　棘胸蛙(Quasipaa spinosa(David, 1875)。

　　注：别名：石蛤、石鸡、石蛙等

　　4.2 分类地位

　　脊索动物门(Chordata)，脊椎动物亚门(Vertebrata)，两栖纲(Amphibia)，无尾目(Anura)，叉舌蛙科(Dicroglossidae)，棘胸蛙属(Quasipaa)。

　　5 主要形态结构特征

　　5. 1 外部形态特征

　　5.1.1 外形

　　DB34/T 5406—2026

　　成体背面黑棕色或棕黄色，散布着不规则分布的疣状物。四肢背面黑褐色， 横纹直达指、趾端。腹面肉色，有灰褐色小云斑。皮肤较粗糙， 雄蛙胸部有大小肉质疣刺，刺疣向前可达咽喉部，雌蛙腹面光滑。成体头宽大于头长， 吻端圆，下唇突出，吻棱不显，颊部略向外倾斜。鼻孔在吻眼之间， 略近于眼，眼后方有横置的肤沟，颞褶十分显著。鼓膜不明显。犁骨齿强， 舌卵圆形，后端缺刻深。前臂和指长近于体长 1/2，指略扁，指端圆，第一指长于第二指;第二、第三指内侧缘蹼清晰， 原拇指发达，指基部关节下瘤明显，近球形。掌突 3 个，内掌突大，卵圆形。后肢粗壮，胫长约为体长 1/2，趾端球形，第一、第五趾游离侧缘膜明显，达蹠基部，趾全蹼。关节下瘤明显近圆形;跗褶清晰，超过跗长 1/2。雄蛙第二性征明显，胸部有大小疣刺，前臂极粗壮，原拇指及内侧三指有黑色锥状刺。棘胸蛙成体外形见图1，棘胸蛙雌、雄背、腹面观见图2.

　　图1 棘胸蛙外形图(侧面观)

　　图2 棘胸蛙背、腹面观(左雌、右雄)

　　5.1.2 可量性状

　　棘胸蛙实测可量性状比例值见表1。

　　表1 棘胸蛙实测可量性状比例值

　　单位为厘米

　　5.2 内部结构

　　5.2.1 声囊

　　雄蛙咽部有 1 对内声囊，开口于口咽腔;雌蛙无声囊。

　　5.2.2 脊椎

　　脊椎骨 10 枚，其中颈椎骨 1 枚、躯椎骨 7 枚、荐椎骨 1 枚、尾杆骨 1 枚。属前凹后凸的参差型椎体。

　　5.2.3 生殖系统

　　5.2.3.1 雄蛙有一对浅黄色椭圆形睾丸，位于腹腔背侧、肾前腹面，睾丸前有金黄色指状脂肪体，数量与大小因个体和发育阶段而异。

　　5.2.3.2 雌蛙具一对多叶囊状卵巢，位于腹腔背侧、肾前腹面，生殖期膨大并含大量黄黑色卵粒。卵巢前有一对金黄色脂肪体，数量与大小因个体和发育阶段而异。

　　6 生长和繁殖特性

　　6.1 生长

　　棘胸蛙的体长与体重实测值见表2。

　　表2 棘胸蛙体长与体重实测值

　　6.2 繁殖

　　6.2.1 性成熟年龄

　　雌、雄蛙性成熟年龄均为 2 龄。

　　6.2.2 产卵季节

　　产卵的季节为 4～9月，产卵盛期为 5～7月，一般雌性每年产卵 2～3 次。

　　6.2.3 产卵水温

　　适宜产卵水温为 18℃~24℃。

　　6.2.4 产卵类型

　　产粘性卵，具胶质外膜;多次产卵，每年产卵 2～3 次。卵球形，卵径 1.2 mm～1.5 mm，动物极深棕色,植物极淡黄色。

　　6.2.5 绝对怀卵量

　　产卵量随雌体的大小而异，一般一年总产卵量为 1000～2800 粒。

　　7 遗传学特性

　　7.1 细胞遗传学特征

　　体细胞染色体数：2n=26;核型公式：2n=18m+4sm+4st;染色体臂数：NF=44。

　　染色体核型图见图3 A)，染色体组型见图3 B)。

　　A) B)

　　图中：

　　m —中部着丝点染色体;

　　sm —亚中部着丝点染色体;

　　st —亚端部着丝点染色体。

　　图3 棘胸蛙染色体组型(2n=26)

　　7.2 分子遗传学特性

　　7.2.1 棘胸蛙线粒体 Cytb基因为 817 bp，电泳图谱(Marker 为 DL 1000)见图 4。

　　图4 棘胸蛙线粒体 Cytb 基因电泳图谱

　　7.2.2 棘胸蛙线粒体 DNA 样本扩增片段测序后与棘胸蛙线粒体 Cytb 基因标准序列进行同源比对，同源性为 100%。棘胸蛙线粒体 Cytb 基因如下：

　　5’-AACACAATTCTTTCACTATTTCTACTAGGATTTTAACCTAGACTGATAGTCTGAAAAACTACTGTTGTACTTCAACTATAAAAAC CTATTCTATGGCCCCAGCCCGAAAATCTCACCCAATCTTAAAAATTATTAACTATGCATTTATTGACCTCCCTGCCCCAGCAAATTTGT CTTCTTGATGAAACTTTGGCTCCCTCCTCGGACTCTGCTTAATTATCCAAATCGCACAGGCCTATTTCTTGCAATACACTATACAGCAG ACACATCTATAGCCTTTTCATCAATTGCCCATATTTGTCGGGATGTAAACAACGGCTGACTCCTTCGCAACCTTCACGCCAACGGAGCC TCCTTCTTTTTTATCTGCATCTATTTACACATTGGCCGAGGTTTATATTATGGATCATTCCTTTTCATGGAAACCTGAAACGTAGGTGT AATCCTCCTTTTTTTAGTCATAGCCACAGCCTTTGTCGGATATGTTCTACCATGAGGCCAAATATCCTTCTGAGGCGCTACAGTCATTA CTAACCTCCTCTCAGCCGCCCCCTATATCGGTACTAACCTAGTCCAATGAATCTGGGGCGGCTTCTCAGTAGACAATGCCACCCTAACC CGATTCTTCTCTTTCCACTTTATTCTCCCTTTCGCTATCGCCGGGGCAAGCATAATCCACTTATTATTCCTCCATCAAACAGGATCATC CAATCCAACCGGCCTTAATCAAAATCTAGATAAAGTCCCCTTCCACTCTTATTTCTCTTACAAAGACCTCCTCGGATTCGCTATTATAG TTGGCGCACTAGCGGGTCTATCAACCTTCTCCCCAAACCTCCTAGGTGACCCAGACAATTTTACACCAGCAAA-3’

　　8 检测方法

　　8. 1 抽样

　　按 GB/T 18654.2 的规定执行。随机抽取蛙池， 生物学检测样本不少于 30 只，繁殖检测雌、雄蛙样本各不少于 15 只。

　　8.2 主要形态构造特征测定

　　8.2.1 外部形态特征

　　8.2.1.1 外形观察

　　自然光下观察。

　　8.2.1.2 可量性状和可数性状的测定

　　按 GB/T 25884 的规定执行。

　　8.2.2 内部结构特征

　　8.2.2.1 脊椎骨的测定

　　解剖、蒸煮剔肉，取整条脊椎骨，观察脊椎骨数量。

　　8.2.2.2 生殖系统的检测方法

　　自然光下观察，辨别雌雄，剖开腹腔观察生殖系统各器官的形态特征。

　　8.3 生长与繁殖

　　8.3.1 性成熟年龄鉴定

　　8.3.1.1 样品采集与固定

　　剪取棘胸蛙第 2 趾骨，清洗晾干后，投入 80%乙醇中固定硬化 10～15 小时，年龄鉴定相关试剂见附表A.1。

　　8.3.1.2 脱钙处理

　　将固定后的样品经蒸馏水短暂冲洗，移入 3%硝酸水溶液中脱钙约 24 小时。脱钙终点判断标准为针尖轻刺无硬芯、质地柔软。

　　脱钙完成后，以流水冲洗 2～4 小时，彻底去除残留酸液。

　　8.3.1.3 石蜡切片与染色

　　8.3.1.3.1 脱水透明：样品依次经梯度乙醇(70% →80% →90% →95% →100%I→ 100%II)脱水，每级 1～1.5 小时;随后移入二甲苯中至组织完全透明。

　　8.3.1.3.2 浸蜡包埋：将透明样品置于 56℃~58℃石蜡中浸渍 2～3 次，每次≥1 小时;包埋时使趾骨长轴垂直于切片方向，以利观察年轮。

　　8.3.1.3.3 切片与贴片：用旋转式石蜡切片机连续切片，厚度 5～8 μm，于 42℃温水中展平，载玻片捞片后 60℃烘干。

　　8.3.1.3.4 H&E 染色、脱蜡至水：依次经二甲苯 2 次、梯度乙醇(100% →95% →80% →70%)至蒸馏水;苏木精染色 5～10 分钟，1%盐酸乙醇分化，流水返蓝;0.5%伊红复染 1 –3 分钟;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　8.3.1.4 年轮观察与判读

　　显微镜(10×20)下观察，可见黑色狭窄带(年轮标志) 与淡红色宽带相同排列，1个黑色带计为1 龄，依此类推。

　　8.3.2 生长的测定

　　按 GB/T 25884 的方法测量。

　　8.3.3 绝对怀卵量的测定

　　解剖棘胸蛙亲本，取出卵巢，按 GB/T 18654.6 的方法测定。

　　8.4 染色体检测

　　8.4.1 染色体制备

　　8.4.1.1 试剂

　　染色体检测相关试剂见附表A.2。

　　8.4.1.2 预处理

　　在取样前 4～6 h，按每克体重 10～15 μg的剂量，通过腹腔注射秋水仙素溶液。

　　8.4.1.3 取样与低渗

　　解剖后，取股骨与胫骨骨髓，置于0.2%KCl溶液中，37℃水浴低渗 20～30 min。

　　8.4.1.4 固定

　　以 1500 r/min 离心 10 min，弃上清;加入 4 mL 固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)，37℃固定 15 min;重复固定 2 次。

　　8.4.1.5 制片与染色

　　加入少量固定液制备细胞悬液，滴片，文火烘干;用吉姆萨(Giemsa)工作液(按 GB/T 18654.12的规定配制)染色 30 min;蒸馏水冲净染液，空气干燥后即可用于观察。

　　8.4.2 染色体计数与核型分析

　　按 GB/T 18654.12 的规定执行。

　　8.5 分子遗传特征检测

　　8.5.1 试剂

　　分子遗传学检测相关试剂见附表A.3。

　　8.5.2 样品制备、DNA 提取与 PCR 扩增

　　样品制备、基因组DNA提取及PCR扩增的其他步骤按 GB/T 18654.14 的规定执行。

　　扩增靶点：线粒体Cytb基因。

　　引物序列：

　　——F:5,-ATAAGGAGACGGATTTGAA-3,

　　——R:5,-AAGTATAGGGTAGAGGCAA-3,

　　PCR反应体系：50 µL。

　　扩增程序：94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸90 s，共 35 个循环; 72℃终延伸 10 min。

　　8.5.3 PCR 产物纯化与回收

　　取 5 µL扩增产物，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，切取目的条带，使用凝胶回收试剂盒进行纯化与回收。

　　8.5.4 测序

　　将纯化后的 PCR产物进行正、反双向测序。

　　8.5.5 序列分析

　　对获得的线粒体 Cytb 基因序列进行比对与分析。

　　9 判定规则

　　9. 1 当检测结果符合第 5 章要求时,可判定该物种。当外部形态特征符合本文件规定,而可量性状不符合本文件规定或与本文件规定有明显差异时，则应结合其他指标综合判定。

　　9.2 当出现下列情况之一，需增加检测其他章节要求内容，依据检测结果对物种进行综合判定。

　　a) 必要时,检测第 7 章或第 8 章的内容;

　　b) 第三方提出要求检测第 6 章全部或部分内容时;

　　c) 全项检测时。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　主要试剂配制方法

　　主要试剂配制方法见表A.1～表A.3。

　　表A.1 年龄鉴定相关试剂

　　表A.2 染色体检测相关试剂

　　表A.3 分子遗传学检测相关试剂