DB43/T 3261-2025 砧用南瓜耐低温鉴定技术规程

　　ICS 65.020.20 CCS B 05

　　43

　　湖 南 省 地 方 标 准

　　DB 43/T 3261—2025

　　砧用南瓜耐低温鉴定技术规程

　　Code of practice for low temperature resistance identification of rootstock pumpkins

　　2025 - 07 - 18 发布 2025 - 10 - 18 实施

　　湖南省市场监督管理局 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由湖南省农业农村厅提出。

　　本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。

　　本文件主要起草单位：湖南省蔬菜研究所、湖南省核农业与中药材研究所、广西大学、邵阳市北塔区农业农村局、湖南呙氏老农民生态农业股份有限公司、怀化市农业综合服务中心、永州市农业综合服务中心、安乡县农业技术推广中心、湘潭市雨湖区农业农村局。

　　本文件主要起草人：殷武平、袁祖华、彭莹、童辉、袁野、阳艳娟、粟启明、呙拉飞、李柯嫱、汪端华、谭善飞、周精华、王波。

　　砧用南瓜耐低温鉴定技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了砧用南瓜苗期耐低温鉴定的育苗、低温处理、指标检测、综合判定和档案管理。

　　本文件适用于砧用南瓜苗期的耐低温性鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 第 2 部分扦样

　　GB/T 16715.1 瓜菜作物种子 第 1 部分：瓜类

　　NY/T 2118 蔬菜育苗基质

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3. 1

　　耐低温性 chilling-resistance

　　砧用南瓜生长发育对低温胁迫的耐受能力。

　　3.2

　　冷害 cold damage

　　0℃以上低温对砧用南瓜的损害。

　　4 育苗

　　4. 1 选种取样与催芽播种

　　砧用南瓜种子质量应符合 GB 16715.1 的要求。取样应符合 GB/T 3543.2 的规定。挑选 300 粒饱满砧用南瓜种子，在 55 ℃温烫水中消毒 15 min，再在 28℃~30℃温水中浸种 6 h，然后在恒温培养箱中30 ℃催芽，待种子萌发露白后播于 32 孔穴盘中。

　　4.2 幼苗培养

　　将已播好样本种子的穴盘置于人工气候室中，昼/夜为 28℃/15℃( 12 h/12 h)、光照强度为 300 μmol.m-2S-1、相对湿度为 75 %。待幼苗生长到“四叶一心”时，参照 GB/T 3543.2 的方法选取长势整齐一致的幼苗，分为 2 组，即低温胁迫处理组和常温对照组，每个处理 96 株，每个处理 3 次重复，每个重复 32 株。将各处理移入相应的人工气候室，待处理。

　　5 低温处理

　　5. 1 处理

　　相对湿度为 75 %，光照强度 300 μmol.m-2S-1，光照时间 12 h，昼/夜温度为 10℃/5℃处理 7 d 后，调查砧用南瓜幼苗的冷害指数，测定砧用南瓜幼苗叶片中的相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量(测定方法见附录 A)，而后转入光照强度 300 μmol. m-2S-1、昼/夜温度为28℃/15℃(12 h/12 h)的人工气候室培养 3 d，统计各处理植株的存活率，档案记载见附录 B.1。

　　5. 2 对照

　　相对湿度为 75 %，光照强度 300 μmol. m-2S-1，光照时间 12 h，昼/夜温度为28℃/15℃ , 7 d 后，测定砧用南瓜幼苗叶片中的相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量(测定方法见附录 A)， 10 d 后统计植株存活率，档案记载见附录 B.1。

　　6 指标检测

　　6. 1 冷害指数

　　冷害程度根据叶片受损情况进行分级(见表 1)，档案记载表见附录 B.1。

　　表1 砧用南瓜冷害分级

　　冷害指数按公式(1)计算：

　　CI = ········································································· (1)

　　式中：

　　CI——冷害指数;

　　s——冷害级别;

　　n——冷害级别的植株数;

　　N ——总植株数;

　　S——冷害最高级别数。

　　6.2 生理指标

　　相对电导率采用电导法测定，档案记载见附录 B.2;丙二醛含量用 2-硫代巴比妥酸法测定，档案记载表见附录 B.3;脯氨酸含量用酸性茚三酮比色法测定，档案记载表见附录 B.4;可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，档案记载表见附录 B.5;

　　7 综合判定

　　7. 1 耐低温性判定

　　采用隶属函数值方法，求出每个品种各检测指标的具体隶属函数值。脯氨酸、可溶性蛋白采用公式(2); 丙二醛、冷害指数采用公式(3);然后把每个品种各指标具体耐低温隶属值进行累加，p-i 采用公式(4);p-i值越大，耐低温性越强。

　　pij = p (pjmax - pjmin) + pjmin ·························································· (2)

　　pij = (1 - p) (pjmax - pjmin) + pjmin ···················································· (3)

　　j = 1,2,3) ····································································

　　式中：

　　p——各指标在低温胁迫下的平均测定值与平均对照值的比值;

　　pij——i 品种j指标的隶属函数值;

　　pjmin——各品种j指标最小值;

　　pjmax——各品种j指标最大值。

　　7.2 耐低温性评级

　　根据 Pij 判断耐低温性强弱，分为 4 级：0.70≦Pij≦1.00 为强耐低温，0.60≦Pij≦0.69 为耐低温， 0.30≦Pij≦0.59 为中等耐低温，0≦Pij≦0.29 为不耐低温，见表 2 ，档案记载见附录 A7。

　　表2 砧用南瓜耐低温性评价标准

　　8 档案管理

　　砧用南瓜存活率统计表及丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白等含量记载表建立档案，档案保存期 2 年。

　　A

　　A

　　附 录 A

　　(资料性)

　　检测指标的测定方法

　　A.1 相对电导率测定

　　采用电导法，分别选取处理组、对照组植株距生长点第 3 片完全展开叶，叶片用蒸馏水冲洗 2 次，吸水纸吸干后，用直径 6 mm～8 mm 的打孔器避开主脉取 0.1 g 叶圆片浸润在 10 mL 去离子水中，置于摇床 25 °C 震荡 30 min，测定第一次电导，记为 EL1;随后置于沸水浴中处理 15 min，于 25 °C 冷却后测定第二次电导，记为 EL2 ，按公式(A. 1)计算相对电导率(relative electrolyte leakage, REL)。

　　REL

　　档案记载见附录 B.2。

　　A.2 丙二醛含量测定

　　采用硫代巴比妥法测定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。选取距生长点第 2-3 片完全展开叶，待测样品经液氮研磨后，加入三氯乙酸 3 mL，静置 10 min 后 4000 rpm 离心 10 min。取上清液 2 mL，加入 2 mL 硫代巴比妥溶液，沸水浴 30 min。测定 450 nm、532 nm、600 nm 波长下的吸光度，根据下公式(A.2)计算出丙二醛 MDA 浓度。

　　c(μmol) = 6.45(A532 - A600) - 0.56A450··········································· (A.2)

　　式中 A450 、A532 、A600 分别代表 450 nm、532 nm、600 nm 波长下的吸光值;

　　进一步按公式(A.3)算出其在植株组织中的含量。

　　MDA = C × N/W ·································································· (A.3)

　　其中 C 为 MDA 浓度，N 为提取液体积，W 为植物组织鲜重。档案记载见附录 B.3。

　　A.3 脯氨酸含量测定

　　脯氨酸标准溶液的配置：准确称取 25 mg 脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至 250 ml，其浓度为 100 μg/ml。再取此液 10 ml，用蒸馏水稀释至 100 ml，即成 100 μg/ml 的脯氨酸标准液。

　　脯氨酸含量用酸性茚三酮比色法测定，选距生长点第 2-3 片完全展开叶，称取新鲜叶片 0.5 g，加入5 ml 13%的磺基水杨酸，沸水中加盖提取 10 min，冷却后过滤，定容至 50 ml，吸取滤液 2 ml，加入 2 ml 冰醋酸和3 ml 酸性水合茚三酮显色液，沸水浴 40 min。冷却至室温，加入5 ml 甲苯，充分振荡，静置分层后取上层溶液 520 nm 下比色。

　　同时以不同浓度的标准液做对比绘制标准曲线，从标准曲线中查出测定液中脯氨酸含量，档案记载见附录 B.3。脯氨酸含量按公式(A.4)计算。

　　F = (C. V)/(a. W) ····························································· (A.4)

　　其中 C 为标准曲线查得提取液中脯氨酸含量，V 为提取液体积，a 为测定时所用样品的体积，W 为样品重。

　　A.4 可溶性蛋白含量测定

　　可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，选距生长点第 2-3 片完全展开叶，取鲜叶 0.5 g，加入2 ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用 8 ml 蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在 4000 r/min 下离心10 min，取上清 2 ml 转入 10 ml 容量瓶中并用蒸馏水定容。另取试管，吸取定容后的样品溶液 0.5 ml，

　　再加入 5 ml 的考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂，充分混合，放置 2 min 后，以空白液为对照，用 1 cm 比色皿在 595 nm 下测定吸光度 OD 值。将蛋白提取液更换成牛血清蛋白浓度梯度溶液，按照相同的方法测定吸光度 OD 值，绘制标准曲线，再用标准曲线算出砧用南瓜叶片中可溶性蛋白的含量，档案记载见附录 B4。可溶性蛋白含量按公式(A.5)计算。

　　Pro = C × V/(a. W) ······························································(A.5)

　　其中 C 为查标准曲线所得每管蛋白质含量，V 为提取液体积，a 为测定所提取液体积，W 为植物鲜重。

　　B

　　B

　　附 录 B

　　(规范性)

　　砧用南瓜耐低温记载表

　　B.1 砧用南瓜存活率统计表见表 B.1。

　　表B.1 砧用南瓜存活率统计表

　　B.2 相对电导率档案记载表见表 B.2。

　　表B.2 相对电导率档案记载表

　　B.3 丙二醛含量档案记载表见表 B.3。

　　表B.3 丙二醛含量档案记载表

　　B.4 脯氨酸含量档案记载表见表 B.4。

　　表B.4 脯氨酸含量档案记载表

　　B.5 可溶性蛋白含量档案记载表见表 B.5。

　　表B.5 可溶性蛋白含量档案记载表