DB32/T 5359-2026 纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定 酶联免疫吸附法

　　江 苏 省 地 方 标 准

　　DB32/T 5359—2026

　　纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性的测定 酶联免疫吸附法

　　Textiles—Determination of reduction activity of allergen derived from pollen and mite and other sources—Enzyme⁃linked immunosorbent assay

　　2026-04-03 发布 2026-05-03 实施

　　江苏省市场监督管理局 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。

　　本文件由江苏省市场监督管理局提出并组织实施 。

　　本文件由江苏省化学纤维标准化委员会归口 。

　　本文件起草单位：江苏省纺织产品质量监督检验研究院 、中国药科大学 。

　　本文件主要起草人 ：卞莹 、王鑫 、周金香 、李裕陆 、邢然 、龚贤荣 、马文权 、张祥琨 、顾加雨 、陈昌斌 、成钢 、李丽 、刘艳容 、樊文楚 、叶青 、刘冲 、王磊 、宋春常 、仇兆波 、崔宏恩 、倪鑫茹 、薛文文 、董雨桐 、孙姗姗 、王思渊 、戴国英 、陆梅 、蒋洁蓉 。

　　引

　　言

　　经整理具有抗细菌 、真菌 、病毒等功能的纺织品 ，满足了消费者对健康和卫生的需求 ，自面世以来其应用领域越来越广泛 。

　　一定条件下 ，可引发人体抗原-抗体反应的过敏原(如螨虫 、花粉来源的过敏原)会通过污染纺织品给消费者的健康带来一些隐患 。 因此，经整理具有去除此类过敏原功能的高性能纺织品越来越受关注和青睐 。

　　这类高性能纺织品的研发 、生产不仅涉及纺织技术还有生物技术 。 当前，由于缺乏现行有效的 、规范统一的测试方法，不同测试结果之间不具有可比性，因此，无法为生产商 、经销商 、消费者以及市场监管部门有效评估此类经整理纺织品的去除过敏原功效提供依据 。为满足市场各相关方获取纺织品去除过敏原性能准确评价的需求 ，本文件提供了一种基于酶联免疫吸附法(Enzyme⁃linked immunosorbent assay， ELISA)测定纺织品的螨虫 、花粉等过敏原去除活性的试验方法 。

　　为响应此迫切需求，基于 ELISA，本文件提供了一种科学的 、有效的 、可行的，可测定纺织品的螨虫 、花粉等过敏原去除活性的试验方法 。需要说明的是，该测试方法不用于人体过敏原检测 。

　　纺织品 花粉、螨虫等过敏原去除活性

　　的测定 酶联免疫吸附法

　　警告——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验 。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

　　1 范围

　　本文件描述了采用酶联免疫吸附法测定纺织品的花粉 、螨虫等过敏原去除活性的方法 。

　　本文件适用于纤维 、纱线 、无纺布 、机织物 、针织物 、编织物等纺织品的花粉 、螨虫等过敏原去除活性测定 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 ，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3.1

　　抗原 antigen

　　被免疫系统识别为外来物，并诱发免疫反应生成抗体的物质 。

　　3.2

　　抗体 antibody

　　B 淋巴细胞响应外来物(抗原)而产生并分泌的，能够与对应抗原特异性结合的免疫球蛋白 。注：免疫球蛋白是抗体的常见同义词 。

　　3.3

　　过敏原 allergen

　　能够诱发机体发生过敏反应的抗原物质，如来源于花粉 、螨虫 、霉菌 、蟑螂或宠物等的特异性蛋白 。注：花粉 、螨虫过敏原示例见附录 A。

　　3.4

　　去除过敏原 allergen reduction

　　采用物理 、化学 、生物等方法减少或去除作用对象上过敏原的过程 。

　　3.5

　　过敏原去除活性 reduction activity of allergen

　　在规定条件下试验后，试样过敏原浓度比空白对照组过敏原浓度减少的百分比 。

　　注 1：以过敏原去除率表示 。

　　注 2：有未经整理纺织品样品作为参比对照时 ，试验后 ，比较试样过敏原浓度比未经整理试样过敏原浓度减少的百分比 。

　　3.6

　　过敏原去除剂 allergen reduction agents

　　能够降低过敏原浓度的无机 、有机化学物质，或生物学物质 。

　　3.7

　　经整理纺织品 treated textiles

　　经过敏原去除剂整理的纺织品 。

　　3.8

　　未经整理纺织品 untreated textiles

　　未经过敏原去除剂整理，材质和性能与经整理纺织品相同或相似的纺织品 。

　　注：测试中用作参比对照 。

　　3.9

　　酶联免疫吸附法 Enzyme⁃linked immunosorbent assay;ELISA

　　利用抗体(3.2)或抗原(3.1)与酶共价结合原理的测试方法 。

　　注：以酶作为标记指示物，以抗原抗体反应为基础，通过色原呈色程度进行结果判断的固相吸附测试方法 。

　　4 原理

　　在试样和对照上 ，滴加一定浓度的过敏原工作溶液 ，在规定的温度下 ，接触 、孵育一定时间 ，用 ELI⁃ SA 法测定试样和对照上过敏原的浓度 。通过比较接触 、孵育后试样与对照上剩余过敏原浓度 ，计算过敏原去除率，以此表示试样的过敏原去除活性，评价试样去除过敏原的效果 。

　　5 试剂和材料

　　5.1 通则

　　所有试剂和材料应适用于生物学试验 。

　　5.2 水

　　符合 GB/T 6682 规定的三级水 。

　　5.3 磷酸盐缓冲溶液(PBS)

　　氯化钠 8.0 g

　　氯化钾 0.2 g

　　磷酸二氢钾 0.2 g

　　十二水合磷酸氢二钠 2.83 g

　　水 定容至 1 000 mL

　　5.4 含吐温⁃20 的磷酸盐缓冲溶液(PBST)

　　5.5 过敏原溶液

　　于-20 ℃或以下温度保存过敏原溶液 。

　　于生物安全柜中，操作过敏原溶液 。

　　5.6 过敏原工作溶液

　　取已知浓度的过敏原溶液 ，用 PBST(5.4)稀释 ，配制成浓度为 10 ng/mL~20 ng/mL 的过敏原工作溶液 。如需要，浓度可调至 100 ng/mL。工作溶液现用现配 。

　　于生物安全柜中，操作过敏原工作溶液 。

　　5.7 过敏原测定 ELISA 试剂盒

　　5.7.1 过敏原测定 ELISA 试剂盒组成见附录 B。试剂盒按照 GB/T 33411 评价，检出限不低于 0.5 ng/mL。

　　5.7.2 可购买市售试剂盒并按照说明配制和使用 。检出限不低于 0.5 ng/mL。

　　6 仪器与设备

　　6.1 容量瓶：1 000 mL、50 mL，A 级 。

　　6.2 天平：精确度 0.1 g 和 0.000 1 g。

　　6.3 微量可调移液器及配套吸头：10 μL、200 μL、1 000 μL。

　　6.4 冰箱：工作温度范围 2 ℃~8 ℃和(-20±2)℃ 。

　　6.5 生物安全柜：Ⅱ级 。

　　6.6 培养箱：工作温度(25±1)℃,(37±1) ℃ 。

　　6.7 酶标仪：波长范围 450 nm~620 nm，最大允许误差：±5 nm。

　　6.8 聚乙烯自封袋：(60±2)mm×(85±2)mm。

　　6.9 凝胶过滤柱：填料为葡聚糖凝胶 G_25;凝胶颗粒直径为 85 μm~260 μm。

　　7 测试准备

　　7.1 试样

　　按照表 1 规定大小或重量 ，直接剪取或称取试样 。共制备试样 6 个 ，其中 3 个用于灵敏度验证试验(7.3)，剩余 3 个用于测试(第 9 章)。

　　表 1 试样制备

　　7.2 对照

　　7.2.1 空白对照

　　取 3 个聚乙烯自封袋(6.8)作为空白对照 。

　　7.2.2 参比对照

　　如有未经整理纺织品样品，可作为参比对照 。按照表 1 规定，制备 6 个未经整理试样，其中 3 个用于灵敏度验证试验(7.3)，剩余 3 个用于测试(9)。

　　7.3 ELISA 灵敏度验证试验

　　7.3.1 步骤

　　7.3.1.1 取 3 个试样(7.1)分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8)，各加入 1 000 μL PBST(5.4)。

　　7.3.1.2 如有作为参比对照的未经整理试样(7.2.2)，取 3 个分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8)，各加入

　　1 000 μL PBST(5.4)。

　　7.3.1.3 折叠自封袋中的试样(或作为参比对照的未经整理试样)，不少于 4 层，立即挤压试样数次，取出试样，回收样液 。

　　7.3.1.4 用移液器分别取各自封袋中回收液 100 μL，加入相应过敏原抗体包被板(B.1)微孔中 。每份回收液各 2 孔 。

　　7.3.1.5 另取 2 孔包被板(B.1)微孔，各加入 100 μL PBST(5.4)。 以此作为阴性对照 。

　　7.3.1.6 将包被板置于培养箱(6.6)中 ，25 ℃ , 孵育(30±5)min 后 ，去除反应孔中液体 。用 300 μL PBST (5.4)洗板，重复洗板步骤，共洗 3 次 。

　　7.3.1.7 用移液器吸取 100 μL 过敏原工作溶液(5.6)加入包被板(B.1)各微孔中 ，参照附录 C 方法完成测试 。利用标准曲线计算过敏原浓度，单位为 ng/mL，保留 2 位小数 。

　　7.3.2 要求

　　计算试样和阴性对照的过敏原浓度，ELISA 灵敏度验证应满足公式(1)：

　　|( Sn - St)Sn × 100 |< 20% …………………………( 1 )

　　式中：

　　Sn——3 个阴性对照测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留 2 位小数;

　　St ——3 个试样回收液测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留 2 位小数 。

　　如有作为参比对照的未经整理试样，则 ELISA 灵敏度验证应满足公式(2)：

　　|( Sn - Su)Sn × 100 |< 20% …………………………( 2 )

　　式中：

　　Su——3 个 未 经 整 理 试 样 回 收 液 测 得 的 过 敏 原 浓 度 均 值 ，单 位 为 纳 克 每 毫 升(ng/mL)，保 留 2 位小数 。

　　上述数值<20% 时，说明样品基质(除分析物外的化学物质)没有影响 ELISA 测试结果准确性 。

　　如果数值≥20%，说明回收液(7.3.1.4)中所含化学物质对 ELISA 测试结果产生影响，需将回收液纯化后再验证，按照 7.3.3 操作 。

　　7.3.3 回收液纯化及验证

　　7.3.3.1 用移液器将各自封袋袋中的回收液(7.3.1.4)转移至凝胶过滤柱(6.9)。 按照市售过滤柱说明书

　　进行纯化操作，回收滤液 。

　　7.3.3.2 分别取各滤液 100 μL，加入包被板(B.1)微孔中 。每份样液各 2 孔 。

　　7.3.3.3 其余操作同 7.3.1.5~7.3.1.7。

　　7.3.3.4 按照 7.3.2 验证，直至数值<20%。

　　8 过敏原标准曲线绘制

　　8.1 选取浓度介于检测限浓度与 20 ng/mL 之间的 7 个点绘制过敏原标准曲线 。

　　8.2 采用 2 倍稀释，用 PBST(5.4)稀释已知准确浓度的过敏原标准溶液 。

　　8.3 用 移 液 器 吸 取 100 μL 各 浓 度 过 敏 原 标 准 溶 液 ，加 入 过 敏 原 抗 体 包 被 板(B.1)微 孔 中 。 每 个 浓 度各 2 孔 。

　　8.4 参照附录 C 方法，测定各浓度过敏原标准溶液对应的 450 nm 处的吸光度值(OD)。

　　8.5 参见附录 D，绘制过敏原标准曲线 。每次试验均绘制标准曲线 。经适当验证后，其他过敏原标准曲线也可使用 。

　　9 测试步骤

　　9.1 准备

　　9.1.1 试样

　　取 3 个试样(7.1)分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8)，用移液器吸取 1 000 μL 过敏原工作溶液(5.6)，滴加在试样中心，封口 。如试样吸收过敏原工作溶液过多，导致自封袋中样液过少，可增加过敏原溶液至

　　5 000 μL。

　　9.1.2 对照

　　9.1.2.1 空白对照

　　取 3 个聚乙烯自封袋(6.8)，加入与 9.1.1 相同体积的过敏原工作溶液，封口 。

　　9.1.2.2 参比对照

　　如有未经整理试样作为参比对照(7.2.2)，取 3 个分别放入 3 个聚乙烯自封袋(6.8)，用移液器吸取与9.1.1 相同体积的过敏原工作溶液(5.6)，滴加在未经整理试样中心，封口 。

　　9.2 接触孵育

　　将准备好的自封袋(9.1)放入培养箱(6.6)中 ，25 ℃ , 静置 ，接触孵育 2 h。协议双方可根据需要规定孵育时间，不宜超过 24 h。

　　9.3 样液回收

　　静置孵育结束后，折叠自封袋中的试样，不少于 4 层，挤压试样数次后，取出试样(或作为参比对照的未经整理试样)，回收样液 。

　　如 ELISA 灵敏度验证试验(7.3)中 ，回收液经纯化操作 ，此处经回收的样液按照 7.3.3.1 进行纯化操作 。

　　9.4 ELISA 测定

　　用移液器分别取各自封袋中溶液或纯化回收的溶液 100 μL，加入过敏原抗体包被板(B.1)微孔中 。每份样液各 2 孔 。

　　参照附录 C 方法，完成测定 。利用标准曲线计算过敏原浓度，单位为 ng/mL，保留 2 位小数 。

　　10 过敏原去除率计算与表示

　　比较试样与空白对照的过敏原质量浓度，按公式(3)计算过敏原去除率 。

　　P = ( Rb - Rt)Rb × 100 …………………………( 3 )

　　式中：

　　P ——过敏原去除率，以百分比(%)表示，保留 2 位小数;

　　Rb ——接触孵育 2 h 后 ，3 个空白对照测得的过敏原浓度均值 ，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留 2位小数;

　　Rt ——接触孵育 2 h 后 ，3 个试样回收液测得的过敏原浓度均值 ，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留2 位小数 。

　　如果有作为参比对照的未经整理试样，经协商，按公式(4)计算过敏原去除率 。

　　P = ( R u - Rt)R u × 100 …………………………( 4 )

　　式中：

　　R u——接触孵育 2 h 后 ，3 个未经整理试样回收液测得的过敏原均值 ，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留 2 位小数 。

　　11 回收率

　　如有未经整理纺织品样品作为参比对照 ，可参照附录 E 计算方法的过敏原回收率 。 回收率可验证方法的准确性和可靠性 。

　　12 重复性和再现性

　　实验室间比对已由 5 个实验室参与进行 ，结果参见附录 F。重复性和再现性根据附录 F 计算 ，结果参见附录 G。

　　13 测试报告

　　测试报告应包含以下信息：

　　a) 采用的文件(本文件编号);

　　b) 样品信息;

　　c) 测试用过敏原信息，如，来源 、种类(示例见附录 A);

　　d) 测试结果，如以未经整理试样作为参比对照计算过敏原去除率，请注明;

　　e) 任何偏离本文件的细节和异常;

　　f) 测试日期;

　　g) 如商用 ELISA 试剂盒，详细注明生产商 、产品名称 、产品编号或批号等信息 。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　花粉、螨虫过敏原

　　本文件中所使用的来源于花粉 、螨虫的过敏原示例见表 A.1。适当验证后，可使用其他过敏原 。

　　表 A.1 本文件中所使用花粉、螨虫过敏原

　　附 录 B

　　(资料性)

　　试剂盒组成示例

　　B.1 过敏原抗体(一抗)包被板

　　B.1.1 过敏原抗体溶液

　　过敏原抗体 50~200 μg

　　PBS(5.3) 定容至 50 mL

　　配制后立即使用 。

　　B.1.2 用移液器吸取 100 μL 过敏原抗体溶液(附录 B.1.1)加入酶标板的各微孔中 ，4 ℃ , 孵育 18h，制得过敏原抗体包被板 。

　　注：过敏原抗体包被板是指微孔表面包被有对应过敏原抗体的酶标板 。

　　B.2 酶标记的过敏原检测抗体(二抗)溶液

　　完全溶解后，使用前置于 4 ℃ 保存 。配制后 4 h 内使用 。

　　B.3 显色液

　　B.3.1 底物 A 液

　　醋酸钠

　　柠檬酸

　　过氧化氢(30%)水

　　B.3.2 底物 B 液

　　醋酸钠

　　柠檬酸

　　3，3’，5，5 ’⁃四甲基联苯胺水

　　13.6 g

　　1.6 g

　　0.3 mL

　　定容至 1 000 mL

　　13.6 g

　　1.6 g

　　0.2 g

　　定容至 1 000 mL

　　将底物 A 液( B.3.1)和底物 B 液( B.3.2)按体积 1∶1 混合配制成显色液 。

　　B.4 终止液

　　浓硫酸(98%) 54.3 mL

　　水 定容至 1 000 mL

　　完全混匀后，使用前置于室温保存 。

　　附 录 C

　　(资料性)

　　酶联免疫吸附法：夹心 ELISA 法

　　C.1 包被板(B.1)各微孔中加入 100 μl含有过敏原的溶液后，37 ℃ , 静置孵育 60 min。去除微孔中液体 。 C.2 用移液器吸取 300 μL PBST(5.4)洗涤包被板，重复洗板步骤，共洗 3 次 。此步骤可用洗板机完成 。将微孔板倒置洁净的吸水纸上，去除剩余残液 。

　　C.3 用移液器吸取 100 μL 酶标记的过敏原检测抗体溶液(B.2)加入包被板各微孔中 ，37 ℃ , 静置孵育30 min。去除微孔中液体 。

　　C.4 重复 C.2操作 。

　　C.5 用移液器吸取 100 μL 显色液(B.3)加入包被板各微孔中，室温 、避光，显色 5 min。

　　C.6 用移液器吸取 50 μL 的终止液(B.4)加入包被板各微孔中，终止反应 。待测 。

　　C.7 用 酶 标 仪(6.7)在 450 nm 下 读 取 并 记 录 各 微 孔 中 的 吸 光 度 值(OD)。 读 取 数 据 在 加 入 终 止 液 后30 min 内进行，否则将影响检测结果 。

　　附 录 D

　　(资料性)

　　过敏原标准曲线

　　使用 4 参数 logistic 的过敏原标准曲线的示例见图 D.1。校准曲线的回归方程通常由 ELISA 试剂盒生产商通过计算软件编制 。如没有，可通过商用统计软件计算 。

　　图 D.1 过敏原标准曲线示例

　　附 录 E (资料性) 回收率

　　E.1 回收率的计算与表示

　　接触孵育后，比较作为参比对照的未经整理试样回收液与空白对照的过敏原浓度，按公式(E.1)计算过敏原回收率 。

　　R = R u /Rb × 100 …………………………( E.1 )式中：

　　R ——过敏原回收率(%)，保留 2 位小数;

　　Rb——接触孵育 2 h 后，3个空白对照测得的过敏原浓度均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)，保留 2 位小数;

　　R u ——接触孵育 2 h后，3个未经整理试样回收液测得的过敏原浓度(ng/mL)均值，保留 2 位小数 。 E.2 回收率参考

　　回收率宜≥70%，示例参见表 F.4 和表 F.5。

　　附 录 F

　　(资料性)

　　实验室间对比结果

　　F.1 参与者

　　五个实验室参与实验室间比对 。

　　F.2 试验条件

　　试验用材料及测试条件见表 F.1。

　　表 F.1 材料及测试条件

　　F.3 测试结果

　　F.3.1 ELISA 灵敏度验证试验

　　各实验室 ELISA 灵敏度验证试验结果见表 F.2。灵敏度验证值见表 F.3，所有实验室均满足灵敏度验证要求 。

　　表 F.2 各实验室灵敏度验证试验结果

　　表 F.3 各实验室灵敏度验证值

　　F.3.2 过敏原去除活性测试

　　样品 A 的过敏原去除活性测试结果见表 F.4。样品 B 的过敏原去除活性测试结果见表 F.5。

　　表 F.4 样品 A 的过敏原去除活性测试结果

　　表 F.5 样品 B 的过敏原去除活性测试结果

　　附 录 G

　　(资料性)

　　重复性和再现性

　　根据 ISO 5752⁃2 的统计分析，利用附录 F 所述的实验室间比对结果，确定该方法的重复性和再现性 。结果见表 G.1、表 G.2。

　　表 G.1 过敏原去除率测试重复性与再现性验证总表

　　表 G.2 方差分析(ANOVA)表和不确定性

　　结果表明，由测试重复引起的变异性(VR)和由实验室差异引起的变异性(VL)不显著 。标准不确定度计算 。

　　——重复性引入的标准不确定度：

　　σ(e2)=[V(e2')/4]1/2=[1.39/4]1/2=0.589 ——再现性引入的标准不确定度：

　　σ(e1)={[V(e1)-V(e2')]/4}1/2={[3.85-1.39]/4}1/2=0.406

　　参 考 文 献

　　[1] GB/T 40175.2—2021 纺织品 生物化学分析方法 第 2 部分：拟除虫菊酯类农药(酶联免疫法)

　　[2] T/CNLIC 0104—2023 家用和类似用途洗衣机 、干衣机的除过敏原 、除异味和除螨功能技术要求及试验方法

　　[3] ISO 4333：2022 Textiles—Determination of reduction activity of specific proteins derived from pollen，mite and other sources on textile products.

　　[4] ISO 5725 ⁃ 2 Accuracy(trueness and precision) of measurement methods and results—Part 2： Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method

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