DB32/T 5377-2026 人源心脏类器官在化学品毒性测试中的应用技术规范

　　江 苏 省 地 方 标 准

　　DB3 2/T 5 37 7 —2 02 6

　　人源心脏类器官在化学品毒性测试中的

　　应用技术规范

　　Technical specifications for the use of human heart organoid in

　　chemical toxicity testing

　　2 02 6 ‑04 ‑03 发布 2 02 6 ‑05 ‑03 实施

　　江苏省市场监督管理局 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草 。

　　本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。

　　本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施 。

　　本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口 。

　　本文件起草单位：南京医科大学 、同济大学附属东方医院 、苏州疾病预防控制中心 。

　　本文件主要起草人：顾爱华 、徐进 、杨杨 、刘倩 、周勇 、吉贵祥 、李仲 、蒋兆彦 、邵文涛 、李庆国 、胡佳 、金经 、郭文慧 、顾杰 。

　　人源心脏类器官在化学品毒性测试中的

　　应用技术规范

　　1 范围

　　本文件给出了人源心脏类器官在化学品毒性测试中的原理和技术要求 。

　　本文件适用于人源心脏类器官在化学品毒性测试中的技术规范 。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中 ，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 。

　　GB/T 25915.5 洁净室及相关受控环境 第 5 部分：运行

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 。

　　3 .1

　　人源心脏类器官 human heart organoid

　　由人多能干细胞体外分化组装获得的，包含心肌细胞和多种心脏非心肌细胞在内的腔室化结构 。注：其生理结构和功能与人类心脏高度相似，具有收缩和舒张功能 。

　　3 .2

　　毒性测试 toxicity testing

　　通过实验方法评估化学品等对生物体潜在有害作用的过程 。

　　3 .3

　　阳性对照 positive control

　　按照本文件试验可产生人源心脏类器官毒性反应的化学品 。

　　注：阳性对照的目的是显示适用试验系统的反应 。

　　[来源：GB/T 16886.5—2017，3.2，有修改] 3 .4

　　空白 blank

　　含人源心脏类器官 ，不含试验化学品和试验化学品溶剂的参照组 ，试验期间置于与试验组相同的培养板中，并经受与试验组相同的条件 。

　　[来源：GB/T 16886.5—2017，3.3，有修改] 3 .5

　　阴性对照 negative control

　　按照本文件试验时不产生人源心脏类器官毒性反应的化学品 。

　　注：阴性对照的目的是显示细胞的背景反应 。

　　[来源：GB/T 16886.5—2017，3.4，有修改]

　　3 .6

　　溶剂对照 solvent control

　　含人源心脏类器官和试验化学品溶剂，不含试验化学品，试验期间置于与试验组相同的培养板中，并经受与试验组相同的条件 。

　　注：溶剂对照的目的是检测试验化学品溶剂可能产生的误差而设置的参照组，以确保试验结果的准确性和可靠性 。

　　4 原理

　　检测化学品处理下 ，合格的人源心脏类器官形态 、存活率 、收缩功能的变化 ，以评价化学品是否存在心脏毒性 。

　　5 要求

　　5.1 环境保障

　　应按 GB/T 25915.5 的要求建立运行体系 ，包括风险控制 、人员培训 、洁净服 、人员行为 、室内物流 、日常清洁等方面的洁净室运行规范 。

　　5.2 人源心脏类器官质量要求

　　5.2 .1 形态

　　状态良好，外观无明显差别，呈三维立体囊球状，内含空腔，直径在 1 mm~ 2 mm 范围内 。

　　5.2 .2 细胞组成

　　心肌组织内形成由心内膜衬里的腔室结构 ，同时包含散在分布的心脏成纤维细胞及内皮细胞 ，外部覆盖完整的心外膜组织 。

　　5.2 .3 功能指标

　　呈现强劲而规律的自主搏动 。

　　5.2 .4 微生物指标

　　微生物指标宜按照 GB/T 40365 进行检测，无微生物污染 。

　　6 试验步骤

　　6.1 分组及布局

　　将合格的人源心脏类器官接种于培养板中，每孔接种 1 个 。培养板布局和处理宜参考附录 A 。根据待测化学品的实际使用浓度或人体内暴露浓度确定其最佳测试浓度范围，并在此范围内设置至少 5 个浓度梯度 。 同时设置溶剂对照 、阳性对照 、阴性对照和空白对照组 。每组至少采用 3 个平行试验样本数 。根据待测化学品毒性特点，经过至少 24 h 培养后，按 6.2~6 .4 确定毒性反应 。

　　6.2 形态检测

　　人源心脏类器官形态检测宜参考附录 B 的规定 。

　　6.3 存活率检测

　　人源心脏类器官存活率检测宜参考附录 C 的规定 。

　　6.4 收缩功能检测

　　人源心脏类器官收缩功能检测宜参考附录 D 的规定 。

　　7 结果评价

　　7 .1 与空白组相比，检测数据下降大于 30% 被认为有人源心脏类器官毒性反应 。

　　7 .2 各组平行样的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效，这种情况下应重复试验 。

　　7 .3 阳性对照 、空白及阴性对照组在试验系统中如无预期反应，应重复整个试验 。

　　8 试验报告和结果评定

　　8.1 试验报告

　　试验报告应至少包括下列各项内容：

　　a) 试验机构名称和地址;

　　b) 试验操作者姓名;

　　c) 试验开始和结束日期;

　　d) 化学品 、阳性对照和阴性对照的信息，包括厂家 、批号 、性状 、配制方法 、浓度等;

　　e) 试验方法 、原理和具体步骤;

　　f) 试验结果;

　　g) 试验人签字或单位签章;

　　h) 结果评定所需的任何其他相关数据 。

　　8.2 结果评定

　　应由有能力根据试验数据做出判定的人员进行结果的总体评定 。任何人源心脏类器官毒性反应可能都是重要的 。但是，这主要预示该化学品潜在的心脏毒性 。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　人源心脏类器官毒性测试的培养板布局与处理

　　A.1 概述

　　本试验方案适用于 96 孔细胞培养板 。其他孔数的多孔板可参考本方案 。

　　A.2 试剂材料

　　A.2 .1 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)，无菌 。

　　A.2 .2 人源心脏类器官培养基，无菌 。

　　A.2 .3 具有疏水表面 、透光良好的非再造聚苯乙烯细胞培养板，无菌 。

　　A.2 .4 阳性对照化学品：包括但不限于阿霉素 。

　　A.2 .5 阴性对照化学品：包括但不限于二甲基亚砜 。

　　A.2 .6 待测化学品 。

　　A.3 仪器设备

　　A.3.1 超净工作台 。

　　A.3.2 细胞培养箱：温度37 ℃ ± 0.2 ℃ , CO ₂浓度 5%±0 .1% ，相对饱和湿度≥95% 。

　　A.3.3 微量移液器 。

　　A.4 试验步骤

　　A.4 .1 培养板宜使用 96 孔板，宜参考以下布局(见图 A .1)。

　　a) 96 孔板边缘孔不接种人源心脏类器官，每孔加入 200 μL PBS 。

　　b) 将合格的人源心脏类器官接种于相应孔中，每孔接种 1 个类器官并加入 200 μL 人源心脏类器官培养基 。

　　c) 空白对照实验布局：96 孔板中 B 行第 7~9 列区域 。设置 3 个平行样本 。

　　d) 阴性对照实验布局：96 孔板中 C 行(溶剂对照)及 D 行的第 7~9 列区域 。每组设置 3 个平行试验样本 。

　　e) 阳性对照实验布局：96 孔板中 F 行(溶剂对照)及 G 行的第 7~9 列区域 。每组设置 3 个平行试验样本 。

　　f) 待测化学品实验布局：96 孔板中 B 行(溶剂对照)及 C 至 G 行(5 个浓度梯度)的第 2~4 列区域 。各浓度设置 3 个平行试验样本 。

　　注：涉及的阴性对照化学品包括但不限于：二甲基亚砜(体积分数不超过 0 .02%);涉及的阳性对照化学品包括但不限于：阿霉素(建议设定浓度为 5 μmol/L)。

　　A.4 .2 人源心脏类器官化学品处理：

　　a) 移除孔板中的培养基;

　　b) 根据图 A .1 布局，每孔加入 200 μL 含特定浓度化学品的人源心脏类器官培养基;

　　c) 将孔板置于细胞培养箱中培养 。

　　图 A.1 人源心脏类器官培养板布局

　　附 录 B

　　(资料性)

　　人源心脏类器官形态检测

　　B.1 仪器设备

　　倒置相差显微镜：具有 4 倍 、10 倍 、20 倍物镜 。

　　B.2 试验步骤

　　使用倒置相差显微镜拍摄人源心脏类器官图像，确保图像清晰且类器官边界与背景对比度高 。

　　B.3 结果分析

　　使用软件对所获取的图像进行综合分析 ，以测量人源心脏类器官的周长和/或面积 。具体操作请参考软件使用说明 。

　　附 录 C

　　(资料性)

　　人源心脏类器官存活率检测

　　C.1 试剂材料

　　C.1 .1 钙黄绿素(Calcein‑AM)/碘化丙啶(PI)双荧光染色试剂 。

　　C.1 .2 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)，无菌 。

　　C.2 仪器设备

　　C.2 .1 倒置荧光显微镜：显微镜激发波长范围为 355 nm~ 675 nm，发射波长范围为 430 nm~ 760 nm 。

　　C.2 .2 微量移液器 。

　　C.3 试验步骤

　　C.3.1 配制 Calcein‑AM/PI 工作液，使其浓度分别为 2 μmol/L 和4.5 μmol/L 。

　　C.3.2 弃去每孔原有人源心脏类器官培养基，PBS 冲洗三遍 。

　　C.3.3 每孔加入 100 μL Calcein‑AM/PI 工作液，孵育 15 min。

　　C.3.4 荧光显微镜下观察染色结果：Calcein‑AM 标记活细胞，呈绿色荧光，激发/发射波长为 494/517 nm; PI 标记死细胞，呈红色荧光，激发/发射波长为 535/617 nm 。

　　C.3.5 采 集 Calcein‑AM 绿 色 荧 光 和 PI 红 色 荧 光 的 整 体 信 号 值 ，根 据 荧 光 强 度 反 映 活 细 胞 和 死 细 胞比例 。

　　附 录 D

　　(资料性)

　　人源心脏类器官收缩功能检测

　　D.1 仪器设备

　　倒置相差显微镜：具有 4 倍 、10 倍 、20 倍物镜 。

　　D.2 试验步骤

　　倒置相差显微镜连续拍摄人源心脏类器官 ，获取 30 s 视频 ，要求视频帧率不低于 50 fps，分辨率不低于 640×480，并确保光源稳定 。

　　D.3 结果分析

　　使用软件对所获取的视频进行综合分析，以获得人源心脏类器官的收缩幅度 、持续时间 、到峰时间等指标 。具体操作请参考软件使用说明 。

　　参 考 文 献

　　[ 1 ] GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价 第 5 部分：体外细胞毒性试验

　　[ 2 ] GB/T 40365 细胞无菌检测通则