T/CVMA 339-2026 犬感染棘球绦虫粪便及其污染牧草样本 采集、处理及检测技术规范

　　ICS 11.220 CCS B 41

　　团 体 标 准

　　T/CVMA 339—2026

　　犬感染棘球绦虫粪便及其污染牧草样本采集、处理及检测技术规范

　　Technical guidelines for the collection, processing, and detection of

　　fecal samples from dogs infected with Echinococcus spp. and contaminated

　　pasture grass

　　2026 - 1 - 14 发布 2026 - 1 - 14 实施

　　中国兽医协会 发 布

　　T/CVMA 339—2026

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由新疆医科大学第一附属医院提出。

　　本文件由中国兽医协会归口。

　　本文件起草单位：新疆医科大学第一附属医院，吉林大学，新疆禹孚生物技术有限公司，新疆医科大学，中农华威制药股份有限公司，新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)，新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心。

　　本文件主要起草人：张文宝、李军、刘明远、刘晓雷、张远利、齐文静、游锡火、丁静、颜明智、韩振翔、李文涛、张耀、吾力江 ·卡马力、班万里、刘帅、王雪、吴川川、田梦潇、陈荣贵。

　　I

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　　引 言

　　两种棘球蚴病(包虫病)，包括细粒棘球蚴病(CE)和多房棘球蚴病(AE ，“虫癌”)，是典型的兽源性人兽共患病。分别是由寄生在犬等犬科动物小肠里的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和/或多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)排出的虫卵感染人，家畜和野生动物所致。棘球蚴病控制的关键点是切断病原循环和对病原在食物链中的感染情况的监测。通过粪便样本检测犬等犬科动物是否感染棘球绦虫及其污染牧草等样本是否有虫卵或虫体组织是评估犬等动物和环境对棘球蚴(包虫)病传播风险因素的关键考量指标。本标准旨在规范样本采集和测定方法，为制定棘球蚴(包虫)病精细化管理的控制策略和措施提供依据。

　　本标准以村为基本单位，采集犬等犬科动物粪便及其污染牧草等样本，通过 ELISA 和 PCR 技术进行病原鉴定，探明村庄与感染相关的环境风险因子和流行病学传播途径的关键环节，评估中间宿主(包括人和牛、羊)被感染的风险，确定棘球蚴(包虫)病的流行级别，指导棘球蚴(包虫)病的防控、环境消毒和放牧管理措施等。

　　本规范的制定参考了国际标准及国内相关技术方案，结合实验室实践经验，旨在为科研机构、疾病防控部门及兽医诊断实验室提供规范野外采样的采集流程，确保样本的代表性、完整性和可溯性，为后续分析提供可靠数据基础，推动棘球蚴(包虫)病的科学防控。

　　II

　　T/CVMA 339—2026

　　犬感染棘球绦虫粪便及其污染牧草样本采集、处理与检测技术规范

　　1 范围

　　本文件规定了以村庄为基本单位，采集棘球绦虫犬科动物粪便样本及其污染牧草等样本，采样材料与人员准备、样本采集方法、样本处理、检测方法的技术要求。

　　本文件适用于科研机构、疾病防控部门及兽医诊断实验室进行各类棘球绦虫样本的采集、处理及阳性样本的确认。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB 19489 实验室生物安全通用要求

　　GB/T 32948 犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　ELISA：酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液(Tris Acetate-EDTA Buffer)

　　5 样本的采集、保存及运输

　　5.1 器材

　　5.1.1 剪刀、镊子、一次性塑料镊子。

　　5.1.2 自制 PE 袋(340 mm*120 mm)、密封塑料袋(340 mm*240 mm)。

　　5.1.3 50 mL 离心管。

　　5.1.4 医疗废物收集袋。

　　1

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　　5.1.5 相机。

　　5.1.6 采样登记本、防水记号笔、签字笔。

　　5.1.7 一次性 PE 手套、无粉乳胶手套或丁腈手套。

　　5.1.8 医用一次性防护服、一次性医用帽子、医用外科口罩、一次性防护鞋套。

　　5.1.9 护目镜(或一次性面屏)。

　　5.2 试剂

　　5.2.1 75 %乙醇。

　　5.2.2 含次氯酸钠消毒剂(1000 ~ 2000 mg/L)。

　　5.3 生物安全要求

　　5.3.1 总则

　　生物安全要求按照 GB 19489 的相关规定进行。

　　5.3.2 采样生物安全要求

　　样本采集人员进入采样现场前做好个人防护，应包括一次性医用帽子、医用外科口罩、医用一次性防护服、无粉乳胶手套或丁腈手套、护目镜(或一次性面屏)、一次性防护鞋套。在采样前及结束后，按规范要求完成个人防护用品的穿脱，同组人员应互相检查个人防护是否符合要求。

　　5.3.3 实验室生物安全要求

　　实验操作需在符合生物安全标准的 P2 实验室进行，操作人员应经过专业培训并获得授权。实验过程中，操作人员需佩戴个人防护设备，如一次性手套、口罩、防护服等。实验废弃物应按照生物安全相关规定进行处理，避免污染环境和造成感染风险。

　　5.3.4 野外采样现场意外暴露处理

　　人员暴露出现皮肤污染，清水冲洗 15 min，用 75 %乙醇棉球消毒并进行包扎，更换污染衣物。样本泄漏时，隔离现场，升级防护(穿防护服等)，固体样本用一次性塑料镊子收集，用含次氯酸钠消毒剂(1000 ~ 2000 mg/L)消毒 30 min 以上。废弃物密封包装，带回实验室处理并记录报告。

　　5.4 采样基本要求、时间及地点

　　5.4.1 采样基本要求

　　在棘球蚴(包虫)病流行区，以村庄为基本单位，每乡随机选择不少于 3 个自然村采集犬粪便和环境样本(牧草、蔬菜及水果等)。

　　每村犬粪便样本和环境样本分别不少于 10 份，样本不足时可以采集邻村相应样本进行补充。

　　5.4.2 采样时间

　　春季(4 ~ 5 月)和秋季(9 ~ 10 月)。

　　5.4.3 采样地点

　　2

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　　5.4.3.1 粪便样本采集地点

　　粪便样本可采集于养犬户，也可以采集流浪无主犬的粪便;或环境中的其他犬科动物粪便。

　　5.4.3.2 其他环境样本采集地点

　　其他环境样本采集地点应选择在居民区或居民区附近。

　　5.5 样本采集

　　5.5.1 采集方法

　　调查人员应戴一次性乳胶手套及 PE 手套，每次采集应换新手套。

　　采集新鲜犬粪、牧草或蔬菜装入犬粪便样本采集管或环境样本采集袋。每只犬粪便样本量为 10 ~ 20 g，干牧草为 80 g 左右，生菜和草莓为200 ~ 300 g。采集后放入密封塑料袋中密封。

　　样本管或环境样本采集袋应标明采集的地点(县乡村)、时间、户主姓名，犬只颜色、大小类型(体重小于 10 kg 为小型犬，10 ~ 20 kg 的为中型犬，大于 20 kg 的为大型犬)及样本采集的经纬度，并填写样本采集记录表(参见附录 E)。

　　5.5.2 样本保存与运输

　　5.5.2.1 样本保存

　　样本采集完成后，要及时做好整理归类，置 4 ℃冰柜暂存不得超过 48 h。样本到达实验室后须经-80 ℃连续冻存 7 天以上，方可进行后续检测工作。

　　5.5.2.2 样本运输

　　样本运输须符合国家法律法规要求，运送回实验室时应置于密闭、耐压、冷藏的转运箱中。

　　运输动物病原微生物菌(毒)种、样本及病料的人员需经生物安全培训并取得资质认证。

　　6 PCR 检测

　　6.1 仪器设备和耗材

　　6.1.1 微量可调移液器及配套吸头(0.1 μL ~ 2.5 μL ，0.5 μL ~ 10 μL ，10 μL ~ 100 μL ，100 μL ~ 1000 μL)。

　　6.1.2 漩涡振荡器。

　　6.1.3 台式低温高速离心机。

　　6.1.4 高压蒸汽灭菌器。

　　6.1.5 CR 基因扩增仪。

　　6.1.6 核酸电泳仪。

　　6.1.7 核酸电泳槽。

　　6.1.8 凝胶成像分析系统。

　　6.1.9 双层自封袋。

　　6.1.10 尼龙网(100 μm)。

　　3

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　　6.1.11 PE 袋。

　　6.1.12 棉线。

　　6.1.13 夹板。

　　6.1.14 0.2 mL 、1.5 mL 、50 mL 离心管。

　　6.1.15 PCR 扩增管。

　　6.2 试剂

　　6.2.1 洗脱液(见附录 A 中 A.1)。

　　6.2.2 水，按照 GB/T 6682 的规定执行，二级水。

　　6.2.3 10×PCR 缓冲液。

　　6.2.4 dNTPs：dATP 、dTTP、dCTP 、dGTP，每种浓度为 2.5 mmol/L。

　　6.2.5 MgCl2(25 mmol/L)。

　　6.2.6 Taq 酶(5 U/μL)。

　　6.2.7 50×TAE 贮存液(见附录 A.2)。

　　6.2.8 6×上样缓冲液。

　　6.2.9 琼脂糖。

　　6.2.10 100 bp ~ 2000 bp DNA 分子量标准。

　　6.3 引物

　　针对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的特异性靶点基因序列(见附录 B)设计特异性引物，引物序列见附录 C。

　　6.4 对照样本准备

　　用细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫虫体作为阳性对照，用不含细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫虫体的犬粪便或者环境样本作为阴性对照，用双蒸水作为空白对照。

　　6.5 DNA 提取

　　6.5.1 粪便样本 DNA 提取

　　使用商品化 DNA 提取试剂盒提取 DNA。

　　6.5.2 环境样本 DNA 提取

　　6.5.2.1 将采集的牧草、蔬菜、水果等样本，装至双层自封袋中。

　　6.5.2.2 加入 300 mL 洗脱液，双手揉搓不少于5 min，充分冲洗样本表面(参见附录 D.1)。

　　6.5.2.3 将冲洗液用尼龙网进行过滤，过滤后液体收集至 PE 袋中。

　　6.5.2.4 重复 6.5.2.2 和 6.5.2.3 三次，将每次过滤后液体均收集至 PE 袋中。

　　4

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　　6.5.2.5 将 PE 袋用棉线封口固定过夜(参见附录 D.1)。

　　6.5.2.6 打开 PE 袋，弃去一半上清。

　　6.5.2.7 用夹板(参见附录 D.2)夹住底部约 2 cm 处，弃去夹板之上全部上清，将剩余沉淀及上清混匀，转移至 50 mL 离心管，-80℃冻存。

　　6.5.2.8 使用商品化 DNA 提取试剂盒提取 DNA。

　　6.6 PCR 检测操作程序

　　6.6.1 PCR 反应体系

　　PCR 反应体系见附录 E 中 E.1。

　　6.6.2 PCR 反应程序

　　PCR 反应程序见附录E.2。

　　6.7 电泳观察

　　使用 1×TAE 缓冲溶液配制 1.5 %琼脂糖凝胶(按附录 A.3 配制)，取 PCR 产物 5 µL 进行琼脂糖凝胶电泳，恒压 120 V，电泳 25 min±5 min，经凝胶成像分析系统观察结果并成像。

　　6.8 试验成立条件

　　阳性扩增对照有 956 bp 和 510 bp 的扩增产物，阴性对照和空白对照没有条带或仅有引物二聚体，则试验成立，结果有效;否则应重新进行试验。

　　6.9 结果判定

　　6.9.1 若样本出现 956 bp 扩增产物，即可判定为存在细粒棘球绦虫核酸。进一步确定则进行 PCR 产物测序，序列结果与已公开发表的细粒棘球绦虫特异性片段序列进行比对，序列同源性在 95 %以上，可判定待检样品细粒棘球绦虫核酸阳性;否则判定细粒棘球绦虫核酸阴性。

　　6.9.2 若样本出现 510 bp 扩增产物，即可判定为存在多房棘球绦虫核酸。进一步确定则进行 PCR 产物测序，序列结果与已公开发表的多房棘球绦虫特异性片段序列进行比对，序列同源性在 95 %以上，可判定待检样品多房棘球绦虫核酸阳性;否则判定多房棘球绦虫核酸阴性。

　　7 ELISA 检测

　　7.1 仪器设备

　　7.1.1 恒温培养箱。

　　7.1.2 酶标板。

　　7.1.3 酶标仪。

　　7.2 试剂

　　7.2.1 水，按照 GB/T 6682 的规定执行，二级水。

　　7.2.2 洗涤液(参照商品化 ELISA 试剂盒说明进行配制)。

　　5

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　　7.3 样本预处理

　　取 5.5.2.7 保存的样本室温解冻后称取 1 g，加入 1 mL 稀释洗涤液，振荡混匀;4000 rpm 离心 15 min，收集上清液;取 12 μL 上清液与 108 μL 样品稀释液混合，制备 10 倍稀释样品;阳性对照无需稀释。

　　7.4 操作流程

　　使用商品化 ELISA 试剂盒或参照 GB/T 32948 的方法进行。

　　7.5 结果分析

　　如使用商品化 ELISA 试剂盒检测为阳性，或按照 GB/T 32948 的方法检测为阳性，即可判定为棘球绦虫抗原阳性。

　　如使用商品化 ELISA 试剂盒检测为阴性，或按照 GB/T 32948 的方法检测为阴性，即可判定为棘球绦虫抗原阴性。

　　6

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　　附 录 A (规范性)

　　相关溶液配制

　　A.1 洗脱液

　　称取9 g NaCl，加入900 mL蒸馏水，再加入0.5 mL吐温20，定容至1000 mL并混匀，即配即用。

　　A.2 50× TAE贮存液

　　称取242.0 g Tris碱和37.2 g二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA•2H2O)，加入900 mL蒸馏水，再加入57.1 mL冰乙酸，加蒸馏水定容至1000 mL并混匀，高压灭菌后保存于室温。使用时加蒸馏水稀释成1×TAE。

　　A.3 1.5%琼脂糖凝胶

　　将1.5 g琼脂糖放入100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 ℃左右时，用微量移液器加入溴化乙锭或同类型核酸染料10 µL，混匀后铺板。

　　7

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　　附 录 B

　　(资料性)

　　棘球绦虫基因片段参考序列

　　B.1 细粒棘球绦虫基因片段参考序列(Echinococcus granu losus isolate EM6577 mitochondrion, complete genome, GenBank Accession No. PQ874687.1)

　　5,-GTGGTGGGTTGTAAACCCTTTGAAATCTGTGAAGTTAATCAGGAAATTTAACAAATTTTAGG CAAAAATTTCTACGGTTTGATGTGCCTAAAATTTGTTAAATTTTACAACATGTCTTATATATACAAGAC ATATTGTAAAATTTAACAAATTTTAGGCACATCAAACCGTAGAAATTTTTTTGGATTCTACGGTTTGAT GTGCCTAAGTTATAAAAAAATTTTTTTGTAAAGATGCCAGAAAAATTTTTAATATATGGGGTTAATTTA GGTTTAATTTATGATTAGTTGTCTCTTTACTATTTAGTTGATTGTTGCGTGTGATGTAGTTGTTAGGTTA CCTGTGTGTATGTTTGATTTGAAATCATTTTGGTTGTTTTTATTAACAAGACAGGTTGGGTTATGTTGCG GTAGCTATGTCAGAAGTGATATGAGTTAGTTTTAAGCATTAATTATGGATGTTTCCTAGCTATTTTTATT GCGGACATATAAGTTGGCTTATGTTACGGCCATAAGATGGATATTGATGTATCGTATGTTTTGATGTTG GGTGTTTTATGTGTTAGATTGGGTTTGAGTTTTGTGGTGTATTTTTTGTTAGTGGGTGGTTTTAGGTATT TGATTAGGTTTAGATTTTTGTCTACTATGGGTTGTTATTGGTTGATTAATTTTGATTTTGATGTGGTAAC GTTTGGGTTATTGGTGATGCTTTTGACGTGTTTTTTTTATGTTTATTATTATACTGGTCATTATTTCGGCG GTGATTATGTTGGGTTTATGTTGTTGAAGTTGATTGTTTTGTTTGTTAGGATTATGGGGGTGTTGGTATG TAGTGGTGATTATTTATTTACGTTGATTCTTTGAGAGTATTTAGGTGTTGTTAGGTTTTTTTTGATTTTGT TCTATGGTAGTTTTTTGAGTTTACGTTCTTCTATTGTTACGTTGGTGTCGTCTCGG-3,

　　注：下划线部分为细粒棘球绦虫特异性引物目标检测片段;黑体为细粒棘球绦虫特异性引物序列。

　　B.2 多房棘球绦虫基因片段参考序列(Echinococcus multi locularis mitochondrial cob gene for cytochrome b, complete cds, GenBank Accession No. AB461399.1)

　　5,-GGCTGCCACTGTCCTTACTTCAATTGTTGATAGTTTGCCGTTGGTTGGTTCTATGGTCTATAAG TATGTGGTTGGTGGATTTTCGGTGTCGGGTGTAACATTGATTCGTGTGTTATCGGTTCATATTTGTTTGG GGTTTGTTATATTAGGATTAATGTTTGTTCATTTATTTTATCTTCATAAGAGTGGTAACAGTAATCCGTT GTTTTCATTTAATTTGTTTAATGATTTGGTGTATTTTCATTCATATTTTTCTGTTAAGGATTTAGTCTTGT TTATGTTTACTTGTAGATTGGTAGTTTTTTGGTTGTTTTTTGCTCCTGATTTATTGGTAGATATAGAGGC ATATTTAGAGGCTGATTATCTGAAAACTCCTGTTAGTATTAAGCCTGAGTGATATTTTTTAGCCTTTTAT GCTATTCTTCGGTGTATTAATTCTAAGGTTGGGGGGTTGTTGTTGATTTTATCTTTTATTTTTTTCTTATG AGTACCAACTGAGGGTGGCACTAG-3,

　　注：下划线部分为多房棘球绦虫特异性引物目标检测片段;黑体为多房棘球绦虫特异性引物序列。

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　　T/CVMA 339—2026

　　附 录 C

　　(资料性)

　　PCR扩增引物序列

　　PCR 扩增引物名称与序列见表 C.1。

　　表 C.1 PCR 扩增引物名称与序列

　　项目

　　引物

　　序列(5,→3,)

　　片段大小

　　细粒棘球绦虫 Echinococcus

　　granulosus

　　上游引物

　　GTGGTGGGTTGTAAACCCTTTG

　　956 bp

　　下游引物

　　CCGAGACGACACCAACGTAA

　　多房棘球绦虫 Echinococcus multilocularis

　　上游引物

　　GGCTGCCACTGTCCTTACTT

　　510 bp

　　下游引物

　　CTAGTGCCACCCTCAGTTGG

　　9

　　T/CVMA 339—2026

　　附 录 D

　　(资料性)

　　牧草等样本处理方法示意图

　　牧草、蔬菜样本处理方法示意图见图D.1 ，夹板使用操作示意图见图D.2。

　　图D.1 牧草、蔬菜样本处理方法示意图

　　图D.2 处理过程所用夹板示意图

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　　T/CVMA 339—2026

　　附 录 E (资料性) PCR扩增反应

　　E.1 PCR反应体系

　　PCR 反应体系见表 E.1。

　　表E.1 PCR反应体系(50 μL)

　　混合液组分

　　体积(μL)

　　10×PCR 缓冲液

　　5.0

　　上游引物(10 μmol/L)

　　1.0

　　下游引物(10 μmol/L)

　　1.0

　　dNTP(2.5 mmol/L)

　　4.0

　　MgCl2(25 mmol/L)

　　4.0

　　Taq 酶(5 U/μL)

　　0.2

　　DNA 模板

　　2.0

　　ddH2O

　　20.0

　　ddH2O 补齐至总体积

　　50.0

　　E.2 PCR反应程序

　　PCR 反应程序见表 E.2。

　　表E.2 PCR反应程序

　　温度

　　反应时间

　　循环数

　　95 ℃

　　3 min

　　1

　　95 ℃

　　30 s

　　35

　　58 ℃

　　30 s

　　72 ℃

　　1 min

　　72 ℃

　　5 min

　　1

　　_________________________________

　　11