T/CHCIA 007-2022 洗手产品除菌效果的离体试验方法

　　ICS 71.100.40 CCS Y43

　　团 体 标 准

　　T/CHCIA 007—2022

　　洗手产品除菌效果的离体试验方法

　　In-vitro Test Method for Evaluation of Bacterial Removal Efficacy of Hand-wash Formulations

　　2022- 12-20发布 2023-01-20实施

　　中国日用化工协会 发 布

　　T/CHCIA 007—2022

　　目 次

　　工

　　T/CHCIA 007—2022

　　前

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 起草。

　　本文件由中国日用化工协会提出。

　　言

　　第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

　　本文件由中国日用化工协会归口。

　　本文件起草单位：广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、中轻日用化学检验 认证有限公司、中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所、北京绿伞科技股份有限公司。

　　本文件主要起草人：孙廷丽、李彩玲、单承莺、谢小保、随东辉、谢飞鸿、陈静、刘静霞、聂、 林小涵、叶一均、杨义熙、公培龙、王杰。

　　T/CHCIA 007—2022

　　洗手产品除菌效果的离体试验方法

　　1 范围

　　本文件规定了洗手产品除菌效果的离体试验方法。

　　本文件适用于洗手产品除菌性能的测试。

　　本文件不适用于免洗类洗手产品。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。

　　GB5749 生活饮用水卫生标准

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　YY 0569 Ⅱ级生物安全柜

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　洗手产品 handwash formulations

　　日常使用的包含或不包含消毒剂、经洗手过程使用、用以清洁或去除手部污染物的产品总称。 3.2

　　洗手 handwash

　　指用洗手产品和流动水洗手，通过搓洗和冲洗去除载体表面污染物的过程。 3.3

　　除菌 bacterial removal

　　采用物理、化学等方法抑制及去除载体表面附着的细菌或真菌的综合作用。 3.4

　　载体 carrier

　　试验菌的支持物。

　　3.5

　　除菌率 bacterial removal efficacy

　　使用洗手产品洗手前后细菌的含量的减少百分率或对数减少值。

　　4 警告

　　使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验，本文件并未指出所有可能的安全问题，使 用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。试验需在符合微生 物相应安全等级的实验室内进行。

　　5 实验原理

　　将离体仿真皮裁剪成一定大小，人工污染一定数量的细菌，用洗手产品模拟洗手过程清洗污染 后的皮肤，清洗后进行回收计数，比较使用洗手产品后相对仅使用自来水洗手后细菌的数量，得到 产品对细菌去除有效性的结论，并通过比较使用洗手产品前后细菌的数量的减少情况，得到细菌的 去除率。

　　工

　　6 仪器设备

　　6.1 恒温培养箱

　　控温范围：5℃~50℃,温度精度1℃。

　　6.2 干热灭菌箱

　　控温范围：50℃~200℃,温度精度2℃。

　　6.3 生物安全柜

　　应为符合YY 0569规定的IⅡ级生物安全柜。

　　6.4 恒温摇床

　　控温范围：5℃~50℃,旋转频率：20 r/min～300 r/min。

　　6.5 显微镜

　　普通光学显微镜。

　　6.6 冰箱

　　控温范围：2℃~8℃,-18℃~-30℃或-70℃~-80℃。

　　6.7 可调移液器

　　量程：10 μL～100μL 、100μL～1000μL 、1mL～5mL, 配备适用的吸头。

　　6.8 水浴锅

　　控温范围：45℃~55℃。

　　6.9 均质器

　　6.10 密封袋

　　6.11 培养皿、试管、量筒等其它微生物学试验用具及耗材 微生物培养和实验的各个规格。

　　7 试剂和材料

　　7.1 试验菌种

　　革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌 ATCC 6538;

　　革兰氏阴性菌：大肠杆菌 ATCC 25922。

　　注1: 可以使用加入世界菌种保藏联合会 (WFCC) 的菌种保藏机构提供的、与上述菌种等效的菌种;

　　注2: 如果需要，采用其它的试验菌种，培养基、培养温度及培养条件等按照需求进行调整。

　　7.2 培养基和试剂

　　7.2.1 通则

　　所用的培养基和试剂应是分析纯或适合于微生物试验用的。建议使用现有的商品化的脱水原料 制备培养基，并严格按照相关产品制造商的使用说明操作。允许使用其它验证合格的配方和培养基。

　　所用的水应为符合GB/T 6682规定的三级水。

　　7.2.2 营养琼脂培养基

　　蛋白胨 牛肉膏

　　10g 5g

　　氯化钠 琼脂

　　水

　　5g

　　15g

　　1000 mL

　　除琼脂外其它成份溶解于水中，调pH 至7.2～7.4,加入琼脂，加热溶解，分装，于121℃压 力蒸汽灭菌20 min备用。

　　将各成分溶解于水中，调pH 至7.2～7.4,分装，于121℃压力蒸汽灭菌20 min备用。

　　7.2.4 SCDLP 液体培养基

　　酪蛋白胨

　　大豆蛋白胨

　　氯化钠

　　磷酸氢二钾

　　葡萄糖 卵磷脂

　　吐温80 水

　　17.0g

　　3.0g

　　5.0g

　　5.0g

　　2.5g

　　1.0g

　　7.0g

　　1000 mL

　　将各成分加入到水中，待完全溶解后，调pH 至7.0～7.4,于121℃压力蒸气灭菌20 min备 用。

　　7.3 载体

　　离体仿真皮。

　　注：可以使用VITRO-SKIN(IMS) 。 本文件给出这种仿真皮的目的仅为文件的使用者提供便利和参考，并不为 产品背书。文件允许使用其它相似功能的产品作为试验载体。

　　8 试验过程

　　8.1 菌悬液的制备

　　从冰箱取出第3代～10代的标准菌种储备株，在营养琼脂平板上划线活化，于(36±1)℃,培 养18h~24h 。 用接种环从平板上挑取一个单菌落接种到含有50mL营养肉汤培养基的无菌100 mL容 器中，培养18h~24h, 得到最终浓度为10⁸cfu/mL～10⁹cfu/mL的菌悬液。

　　注：如使用其它菌种时，可根据菌种的情况，选择合适的培养基、培养温度及培养条件; 制备好的菌悬液在4h 内尽快用完。

　　8.2 试验载体的准备

　　8.2.1 无菌条件下打开仿真皮包装，将仿真皮剪成6cm×6 cm大小，试验面(一般是粗糙面)向上 备用。每次试验中准备15片裁好的仿真皮，5片用于基线回收取样(即接种后立即洗脱取样),5

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　　片用自来水清洗后作为对照组试样;5片用作洗手产品洗手试样。

　　8.2.2 用水润湿仿真皮表面，纸巾轻拍干燥。

　　8.3 试验菌的接种

　　取0.1mL菌悬液接种于仿真皮表面，涂布棒涂布至整个仿真皮表面，使仿真皮在空气中自然干 燥大约30 s. 重复该过程3次。

　　8.4 基线菌落回收

　　接种完成后，取其中的5块仿真皮，按8.5进行菌落回收，以确定仿真皮表面基线菌落数量(Bo)。

　　8.5 菌落回收和计数

　　8.5.1 将仿真皮分别放入均质袋中，加入10mL SCDLP, 均匀揉搓仿真皮1min, 获得洗脱液。 注：可使用其它验证合格的方式、回收液及回收体积。

　　8.5.2 对洗脱液进行平板计数，如需要可进行10倍梯度稀释，取合适梯度，分别取1mL加入两个 平皿中，倒入营养琼脂或其它合适的培养基，待凝固后置于恒温培养箱中，培养18h～24h, 计 数 平皿上的菌落数量。

　　8.5.3 培养完成后，取出平板计数。每个平板上菌落数在30 cfu～300 cfu范围内为最佳;计算得 出每块皮上的菌落数。

　　8.6 测试样品清洗过程

　　8.6.1 调节水流速至约(4.0±0.3)L/min。洗手试验用的水为市政自来水，其水质要求符合GB5749 的卫生要求。

　　注：可用室温水，水温宜控制在(35±2)℃。

　　8.6.2 轻轻打湿染菌的仿真皮，然后按下列方式进行清洗：

　　1) 以自来水清洗作为对照试验组，搓洗30 s, 流水冲洗30 s;

　　2) 对于固体类产品(如香皂),使用产品擦15s, 整手掌部分搓洗起泡30 s, 流水冲洗

　　30 s;

　　3) 对于液体类产品(如洗手液),称取0.45g 样品至皮表面，整手掌部分搓洗起泡30 s, 流水冲洗30 s;

　　注：洗手方式中产品用量及搓洗时间等也可以由各相关方协商决定，但需要在报告中说明。

　　8.6.3 冲洗完毕，使用无菌纸巾轻轻拍干皮表面。

　　8.7 测试样品及水洗后菌落回收及计数

　　对测试样品和水洗后的仿真皮按照8.5的方法进行菌落回收计数。

　　9 结果计算与评价

　　9.1 平板菌落回收计数结果 按公式(1)进行计算

　　式中：

　　B——每片仿真皮回收菌落数，cfu/片;

　　B₁、B₂——平行平皿上的菌落数，cfu/mL;

　　P——稀释倍数;

　　V——每片仿真皮试样洗脱液的体积，mL/片。

　　9.2 试验有效性检验

　　实验结果应满足如下要求，否则试验无效：

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　　a) 每片仿真皮基线回收菌落数B₀ 不少于10⁶cfu/片;

　　b) 5 片平行仿真皮基线回收菌落数B 的对数值须满足公式(2):

　　式中：

　　IgBo Max——5 片仿真皮基线回收菌落数的最大对数值;

　　IgBo Min ——5 片仿真皮基线回收菌落数的最小对数值;

　　IgBo Mean——5 片仿真皮基线回收菌落数的平均对数值。

　　9.3 除菌效果的计算与评价

　　9.3.1 除菌效果的有效性

　　对依照公式(1)计算获得的5片对照组回收菌落数 (Bc) 的对数值 ( IgBc) 与5片试验组回收菌 落数 (B) 的对数值 (IgB₀) 进行t检验，显著性水平取p≤0.05 (双尾检验),评价测试样品与对照 样品除菌性能是否存在差异，给出结论。当两组样品结果存在显著性差异，且5片对照组回收菌落数 的平均对数值 (lgBc Mean) 大于5片试验组回收菌落数的平均对数值 (lgB, Mean) 时，可认为试验组样 品具有除菌功效，进一步计算其菌去除率。

　　9.3.2 除菌率的计算

　　a) 除菌对数值

　　按公式(3)进行计算

　　RB=1gBoMean-1gBbMean …… …(3)

　　式中：

　　RB——除菌对数值(保留至小数点后两位);

　　IgBo Mean——5片仿真皮基线回收菌落数的平均对数值;

　　IgB Mean——5片试验组仿真皮回收菌落数的平均对数值。

　　b) 百分除菌率

　　按公式(4)进行计算

　　式中：

　　R——百分去除率(保留至小数点后两位),%;

　　BoMean——5片仿真皮基线回收菌落数的平均值，cfu/片;

　　BB Mean——5片试验组仿真皮回收菌落数的平均值，cfu/片。

　　10 报告

　　测试报告需包含以下信息：

　　a) 注明使用本文件;

　　b) 样品信息;

　　c) 测试菌种的详细信息;

　　d) 每次试验中各组别每片离体仿真皮上回收到的菌落数;

　　e) 试验的有效性;

　　f) t 检验结果;

　　g) 除菌率;

　　h) 任何对本文件的偏离。