T/CVMA 205-2024 犬呼吸道症候群六种病原荧光RAA检测方法

ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 205—2024 犬呼吸道症候群六种病原荧光RAA检测方法 Real-time RAA detection method for six pathogens of canine respiratory syndrome 2024 - 12 - 4发布2024 - 12 - 4实施 中国兽医协会发布 前言 本文件按照GB 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：浙江农林大学动物科技学院动物医学院、杭州迅灵生物科技有限公司、浙江领与生物科技有限公司。 本文件主要起草人：金霞、林淦、孙静、邵春艳、吴芹、曾欢、付玉和、刘怡炜、唐浩。 T/CVMA 205—2024 1 犬呼吸道症候群六种病原荧光RAA检测方法 1 范围 本文件描述了犬呼吸道症候群六种病原荧光RAA检测方法。 本文件适用于犬呼吸道症候群（犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒、犬支原体、支气管败血波氏杆菌、犬腺病毒通用型）的快速定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB 27401 实验室质量控制规范动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：黑洞淬灭基团1（black hole quencher 1） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid） FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） MMLV：莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒（moloney murine leukemia retrovirus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline buffer） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） RAA：重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aid amplification） RT-RAA：反转录重组酶介导链替换扩增（reverse transcription-recombinase-aid amplification） Tris：三（羟甲）基氨基甲烷（tri-methylolaminomethane） 5 试剂和材料 T/CVMA 205—2024 2 5.1 试剂 5.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB 6682的要求。 5.1.2 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.1.3 DNA/RNA抽提液：酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）。 5.1.4 异丙醇。 5.1.5 70 %（体积分数）乙醇。 5.1.6 TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 5.1.7 PBS缓冲液（pH 7.4）：8g NaCl，0.2g KCL，1.42g Na2HPO4，0.27g KH2PO4，定容1L 。 5.1.8 启动剂：15 %聚乙二醇，280 mmol/L乙酸镁。 5.1.9 商品化RAA荧光反应单元：包含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶的冻干粉。 5.1.10 商品化RT-RAA荧光反应单元：包含MMLV逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶的冻干粉。 5.1.11 犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒的阳性对照的制备见附录A中A.1，犬支原体、支气管败血波氏杆菌、犬腺病毒通用型的阳性对照见附录A中A.2。 5.1.12 阴性对照为已知犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒、犬支原体、支气管败血波氏杆菌、犬腺病毒通用型阴性的犬口鼻拭子或眼分泌物拭子悬液。 5.2 引物和探针 5.2.1 犬瘟热病毒荧光RT-RAA的引物探针按照附录B中表B.1，特异性扩增片段序列见附录C中C.1。 5.2.2 犬流感病毒（H3N2型）荧光RT-RAA的引物探针按照附录B中表B.2，特异性扩增片段序列见附录C中C.2。 5.2.3 犬副流感病毒荧光RT-RAA的引物探针按照附录B中表B.3，特异性扩增片段序列见附录C中C.3。 5.2.4 犬支原体荧光RAA的引物探针按照附录B中表B.4，特异性扩增片段序列见附录C中C.4。 5.2.5 支气管嗜血波氏杆菌荧光RAA的引物探针按照附录B中表B.5，特异性扩增片段序列见附录C中C.5。 5.2.6 犬腺病毒（通用型）荧光RAA的引物探针按照附录B中表B.6，特异性扩增片段序列见附录C中C.6。 6 仪器设备 6.1 恒温荧光检测仪。 T/CVMA 205—2024 3 6.2 高速冷冻离心机。 6.3 微量移液器：量程0.5 μL ~ 10 μL，10 μL ~ 100 μL，20 μL ~ 200 μL，200 μL ~ 1000 μL。 6.4 涡旋振荡器。 6.5 纯水仪。 6.6 -80 ℃超低温冰箱。 6.7 冰箱：2 ℃ ~ 8 ℃。 7 样品的采集与处理 7.1 通则 样品的采集、保存与运输按照NY/T 541执行。实验室生物安全要求按照GB 19489的规定。 7.2 样品的采集 7.2.1 鼻拭子 用无菌拭子插入鼻腔。轻轻擦拭并慢慢旋转至少3圈，将拭子置于1 mL的PBS缓冲液样品保存管，4 ℃保存备用。 7.2.2 口腔拭子 用无菌拭子在口腔内转动至少3圈，采集口腔分泌物，将拭子置于1 mL的PBS缓冲液样品保存管，4 ℃保存备用。 7.2.3 眼分泌物拭子 用无菌拭子轻轻擦拭眼分泌物后，置于1 mL的PBS缓冲液样品保存管，4 ℃保存备用。 7.3 样品处理 将含有口腔（鼻）拭子或眼分泌物拭子样品保存管在旋涡震荡仪上充分混匀，在4 ℃下3000 r/min离心5 min，取上清液，转移至1.5 mL灭菌离心管中即用。 8 操作方法 8.1 核酸提取 8.1.1 在样本制备区进行，核酸提取使用CTAB法提取，也可采用其他等效核酸提取方法。 8.1.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。 8.1.3 将7.3处理后的样本上清液转移至1.5 mL离心管中，加入600 μL CTAB提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于70 ℃孵育15 min，期间颠倒离心管2 ~ 3次。12000 r/min离心5 min，取上清液于一新的1.5 mL离心管中。 T/CVMA 205—2024 4 8.1.4 加入500 μL酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管2 ~ 3次后涡旋振荡混匀，12 000 r/min离心5 min；转移上层水相至一新的1.5 mL离心管中。 8.1.5 加入0.7倍体积异丙醇，上下颠倒离心管2 ~ 3次，4℃静置30 min，4 ℃下12000 r/min离心3 min，小心弃去上清液。 8.1.6 加入700 μL 70 %（体积分数）乙醇，重悬沉淀，12000 r/min 离心1 min，小心弃去上清液。 8.1.7 打开管盖，室温挥发干液体，加入50 μL ~ 100 μL TE缓冲液（pH8.0）溶解核酸，可直接进行检测或-80 ℃冻存备用。 8.2 扩增试剂的准备与配置 8.2.1 在试剂储存和准备区进行。 8.2.2 扩增反应体系：犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型和犬副流感病毒的RT-RAA反应体系见附录D中表D.1；犬支原体、支气管败血波氏杆菌和犬流感病毒通用型的RAA反应体系见附录D中表D.2。根据8.1.2中提到的n值，按照n+1分别配制六种反应体系，充分混匀后分装，每个反应管20 μL，转移至样本制备区。 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 每个反应管盖加入5 μL提取的核酸，加样顺序为阴性对照、样本、阳性对照，记录反应管对应样本编号，盖紧管盖后，转移至样本扩增区。 8.4 荧光RAA和RT-RAA反应 8.4.1 样本扩增区进行。 8.4.2 将8.3加样后的反应管瞬时离心混匀后放入恒温荧光检测仪中，设置选定FAM 作为报告基团, 选择None作为淬灭基团，RAA和RT-RAA的反应程序如下：39℃，60 s，一个循环；39 ℃，30 s，40个循环，在第二阶段循环结束收集荧光。 9 结果判断与表述 9.1 质量控制 按GB 27401结果质量控制规定执行，阴性对照无荧光对数增长，无相应T值（时间）；阳性对照有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的T值（时间）≤15 min。阴性对照同时成立，实验结果才能判定有效。 9.2 阳性 如T值（时间）≤15 min，则判定被检样品阳性，表述为“检出阳性片段”。如15 min＜T值（时间）＜20 min，则重复一次。如再次检测结果仍然是15 min＜T值（时间）＜20 min，则判定被检样品阳性，表述为“检出阳性片段”。 9.3 阴性 T/CVMA 205—2024 5 如无报告T值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性，表述为“未检出阳性片段”。 T/CVMA 205—2024 6 附 录 A （资料性） 阳性对照的制备 A.1 犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒阳性对照制备 分别合成犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型和犬副流感病毒装甲RNA假病毒（MS2噬菌体假病毒）。分别将装甲RNA假病毒载体转化至大肠杆菌BL21（DE3)表达系统后诱导表达纯化获得装甲RNA病毒颗粒。对提取后装甲RNA病毒颗粒分别进行逆转录和相应病原的荧光PCR检测，检测阳性的，即为用于犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型、犬副流感病毒荧光RT-RAA检测的阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取104拷贝/μL稀释度作为阳性对照。 A.2 犬支原体、支气管嗜血波氏杆菌、犬腺病毒阳性对照制备 分别合成犬支原体、支气管嗜血波氏杆菌和犬腺病毒特异性扩增片段，克隆至pUC57载体，再转化至DH5α感受态细胞，构建重组质粒。提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷贝/μL=[6.02×1023×DNA浓度（ng/μL）×10-9 ]/（DNA碱基数×660）），即为用于犬支原体、支气管败血波氏杆菌和犬腺病毒实时RAA荧光检测的阳性对照母液。将阳性对照母液10倍系列稀释之后，选取104拷贝/μL稀释度作为阳性对照。 T/CVMA 205—2024 7 附 录 B （规范性） 引物和探针序列 B.1 犬瘟热病毒引物探针序列 犬瘟热病毒荧光RT-RAA引物探针序列见表B.1。 表B.1 犬瘟热病毒RT-RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 CDV-F GTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCT 176 N CDV-R GCTTCCACAATGTAGTTATCTATATCAC CDV-P TATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACT[FAM-dT][THF][BHQ1-dT] CTTTGAGGCGATT-C3 Spacer B.2 犬瘟热病毒引物探针序列 犬流感病毒H3N2型荧光RT-RAA引物探针序列见表B.2。 表B.2 犬流感病毒H3N2型RT-RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 CIV-F CAGCGATTTAAGTGATCCTCTCATTATTGC 162 M2 CIV-R CTCATAGACTCAGGCACTCCTTCCGTAG CIV-P AGTATCATTGGGATCTTGCACTTGATAT[FAM-dT][THF][BHQ1-dT] GGATTCTTGATCGT-C3 Spacer B.3 犬副流感病毒引物探针序列 犬副流感病毒荧光RT-RAA引物探针序列见表B.3。 表B.3 犬副流感病毒RT-RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 CPIV-F TATGAGCCGTGGAGAGATCAATGCCTAT 105 N CPIV-R CCATGCCTGCATTAGGACACTGTAACAC CPIV-P GATCTACCTGACACACTAAACCATGCAACACC[FAM-dT][THF][BHQ1-dT] CGTTGATTCCGA-C3 Spacer B.4 犬支原体引物探针序列 犬支原体荧光RAA引物探针序列见表B.4。 表B.4 犬支原体荧光RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 MYC.C-F AATTCTGTGTGAGGAATAATTGAACCTG 103 tuf MYC.C-R AGCAGGAGATAACGCTGGATTATTACTTCG MYC.C-P TGGATTATTACTTCGTGGAGTTAACCGTGAAGA T/CVMA 205—2024 8 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 [FAM-dT][THF][BHQ1-dT] TGAACGTGGACAAG-C3 Spacer B.5 支气管败血波氏杆菌引物探针序列 支气管嗜血波氏杆菌荧光RAA引物探针序列见表B.5。 表B.5 支气管败血波氏杆菌RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 Bb-F ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCAGT 152 dnt Bb-R GGTTTCCAATTTGAAGAAAATGCAGGTG Bb-P CAGTGGTTGATCGCACTCGATGTCTA [FAM-dT][THF][BHQ1-dT]CGGCGTGTTGATCG-C3 Spacer B.6 犬腺病毒通用型引物探针序列 犬腺病毒通用型荧光RAA引物探针序列见表B.6。 表B.6 犬腺病毒通用型RAA引物探针序列 名称 引物/探针序列（5'→3'） 扩增长度 基因 CAV-F AACTCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCT 177 hexon CAV-R GACCTTTCAGTGGTTACATCGTGAGTGG CAV-P AGGACGCCGCCGAATACTTGTCTCCCGCCC[FAM-dT][THF][BHQ1-dT] TCAGTTTGCCCAA-C3 Spacer T/CVMA 205—2024 9 附 录 C （资料性） 目的基因序列 C.1 犬瘟热病毒阳性对照参考序列（GenBank Accession No.PP498905.1） GTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTGGCTTGATATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACTTATCTTTGAGGCGATTCATGGTGGCACTCATCTTGGACATCAAACGATCCCCAGGAAACAAGCTAGAATTGCTGAAATGATTTGTGATATAGATAACTACATTGTGGAAGC 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 C.2 犬流感病毒H3N2型阳性对照参考序列（GenBank Accession No.OR732208.1） CAGCGATTTAAGTGATCCTCTCATTATTGCCGCAAGTATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGTATTTATCGTCACCTTAAATACGGTTTGAAAAGAGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCTGAGTCTATGAG 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 C.3 犬副流感病毒阳性对照参考序列（GenBank Accession No.KU725681.1） TATGAGCCGTGGAGAGATCAATGCCTATGCTGCACTTGCAGAAGATCTACCTGACACACTAAACCATGCAACACCTTTCGTTGATTCCGAAGTCGAGGGAACTGCATGGGATGAGATTGAGACTTTCTAGATATGTGTTACAGTGTCCTAATGCAGGCATGG 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 C.4 犬支原体阳性对照参考序列（GenBank Accession No.LR215010.1） AATTCTGTGTGAGGAATAATTGAACCTGGTTTAGCTAAAACTTGTCCACGTTCAACATCTTCACGGTTAACTCCACGAAGTAATAATCCAGCGTTATCTCCTGCT 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 C.5 支气管败血波氏杆菌阳性对照参考序列（GenBank Accession No.LR134480.1） ACTCGAATACCAGGTCGCTGATCGCAGTGCGGGACAAGGCGGCGATCAACACGCCGAGATAGACATCGAGTGCGATCAACCACTGCAGGATCAATGACTCAGGCTCGAGACGAGCACGAATCGCCACTGCATTTTCTTCAAATTGGAAACC 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 C.6 犬腺病毒通用型阳性对照参考序列（GenBank Accession No.KP840549.1） AACTCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCTTACATGCACATTGCTGGCCAGGACGCCGCCGAATACTTGTCTCCCGCCCTGGTTCAGTTTGCCCAAGCAACCAGTTCTTACTTTAAGTTGGACAACAAGTCAGAAACCCCACTGTGGCCCCCACTCACGATGTAACCACTGAAAGGTC 注：黑体为上下游引物序列；下划线为探针序列。 T/CVMA 205—2024 10 附 录 D （资料性） 反应体系 D.1 犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型和犬副流感病毒荧光RT-RAA反应体系 犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型和犬副流感病毒荧光RT-RAA反应体系见表D.1。 表D.1 犬瘟热病毒、犬流感病毒H3N2型和犬副流感病毒荧光RT-RAA扩增体系 反应液组分 体积（μL） RT-RAA荧光反应单元（25μL冻干粉） - 启动剂 14 正向引物(10 μmol/L) 1.0 反向引物(10 μmol/L) 1.0 探针 0.3 ddH2O 3.7 总体积 20 D.2 犬支原体、支气管败血波氏杆菌和犬腺病毒通用型荧光RAA反应体系 犬支原体、支气管败血波氏杆菌和犬腺病毒通用型荧光RAA反应体系见表D.2。 表D.2 犬支原体、支气管败血波氏杆菌和犬腺病毒通用型荧光RAA扩增体系 反应液组分 体积（μL） RAA荧光反应单元（25μL冻干粉） - 启动剂 14 正向引物(10 μmol/L) 1.0 反向引物(10 μmol/L) 1.0 探针 0.3 ddH2O 3.7 总体积 20