T/CITS 179-2024 抗核抗体间接免疫荧光法检测及临床应用指南

ICS 11.020 CCS C 10 团体标准 T/CITS 179—2024 抗核抗体间接免疫荧光法检测及临床应用指南 Guidelines for antinuclear antibody testing by indirectimmunofluorescence and clinical application 2024-11-27 发布2024-11-27 实施 中国检验检测学会发布 目次 前言................................................................................... I 1 范围................................................................................ 1 2 规范性引用文件...................................................................... 1 3 术语和定义.......................................................................... 1 4 缩略语.............................................................................. 1 5 检测原理与方法...................................................................... 2 5.1 检测原理........................................................................ 2 5.2 检测方法........................................................................ 2 6 开展前准备工作...................................................................... 2 6.1 性能验证........................................................................ 2 6.2 人员培训........................................................................ 2 6.3 仪器校准........................................................................ 2 6.4 制定SOP .........................................................................2 7 IIF-ANA 检测操作.....................................................................3 7.1 检验前.......................................................................... 3 7.2 检验中.......................................................................... 3 7.3 结果判读........................................................................ 3 7.4 结果报告........................................................................ 3 8 质量控制............................................................................ 4 8.1 室内质控........................................................................ 4 8.2 室间质评........................................................................ 5 8.3 数据总结........................................................................ 5 9 ANA 检测的临床应用...................................................................5 9.1 自身免疫性疾病的诊断............................................................ 5 9.2 病情监测与疗效评估.............................................................. 5 参考文献............................................................................... 6 T/CITS 179—2024 I 前言 本文件按照GB 1.1—2020《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由上海交通大学医学院附属同仁医院、欧蒙医学诊断（中国）有限公司、国军标（北京）标 准化技术研究院提出。 本文件由中国检验检测学会归口。 本文件起草单位：上海交通大学医学院附属同仁医院、国军标（北京）标准化技术研究院、欧蒙医 学诊断（中国）有限公司、安徽中医药大学第一附属医院、巴彦淖尔市医院、北京大学深圳医院、北京 实安科技有限公司、北京医学检验学会、北京中检体外诊断工程技术研究中心、福建医科大学附属第二 医院、福建医科大学附属第一医院、福建医科大学附属协和医院、广西医科大学第一附属医院、广西壮 族自治区人民医院、哈尔滨医科大学附属第四医院、湖州市中心医院、华中科技大学同济医学院附属同 济医院、淮安市第二人民医院、江苏三联生物工程股份有限公司、晋江市医院（上海市第六人民医院福 建医院）、兰州大学第一医院、泉州市第一医院、上海交通大学医学院附属儿童医院、上海交通大学医 学院附属仁济医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海市皮肤病医院、上海市第一人民医院嘉定 医院（上海市嘉定区江桥医院）、上海市光华中西医结合医院、上海中医药大学附属岳阳中西医结合医 院、同济大学附属东方医院、无锡市第二人民医院、沃芬医疗器械商贸（北京）有限公司、厦门大学附 属第一医院、新疆医科大学第一附属医院、应急总医院、台州市中心医院、通标伟业（北京）标准化技 术研究院。 本文件主要起草人：盛慧明、林锦骠、刘万阳、李川、戴其全、朱俊、闫利明、杜静、李娜、穆红、 范春梅、陈惠娟、张晓琍、王健、袁育林、薛丽、杜雪飞、邹伟华、吴士及、梁勇、潘维华、朱宗林、 于海涛、张志珊、翁文浩、杜芳、郑冰、郑英霞、罗清琼、伍均、高华利、薛鸾、宗明、龚芳、唐小梅、 宣景秀、李辉、孟存仁、许慧、吴晓宇、许雪英。 T/CITS 179—2024 1 抗核抗体间接免疫荧光法检测及临床应用指南 1 范围 本文件提供了间接免疫荧光法检测抗核抗体的原理与方法、开展前准备工作、IIF-ANA 检测操作、 质量控制和ANA 检测临床应用等方面的指导。 本文件适用于医疗机构、第三方实验室开展抗核抗体检测工作及临床医生对抗核抗体检测结果的解 读和应用。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 抗核抗体antinuclear antibodies；ANA 以真核细胞的各组分为靶抗原的自身抗体总称。 3.2 抗体antibody 机体免疫系统在抗原刺激下，由B 细胞增殖分化为浆细胞后产生的一类能与相应抗原特异性结合并 介导产生体液免疫效应的球蛋白。 [来源：GB 40265—2021，3.1] 3.3 抗原antigen 可以诱导生物体产生抗体的物质，能够被相应抗体识别并与之结合。 [来源：GB 40265—2021，3.2] 3.4 间接免疫荧光法indirect immunofluorescence assay；IIF 用特异性抗体（抗原）与标本中相应抗原（抗体）反应后，再用荧光素标记的第二抗体（抗抗体） 与抗原-抗体复合物中第一抗体结合后，在荧光显微镜下观察特征性荧光，以检测抗原或抗体的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AILD：自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases) CAD：计算机辅助诊断系统（computer aided diagnosis） DM:皮肌炎（dermatomyositis） HEp-2：人喉癌上皮细胞（human epithelioma-2） MCTD：混合性结缔组织病（mixed connective tissue disease） T/CITS 179—2024 2 PM：多发性肌炎（polymyositis） SS：干燥综合征（Sjögren′s syndrome） SSc：系统性硬化症（systemic sclerosis） SLE：系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus） SOP：标准操作程序（standard operation procedure） 5 检测原理与方法 5.1 检测原理 将含有细胞核成分的细胞（如HEp-2）作为抗原底物，与患者血清中的ANA 进行反应，利用抗原抗 体反应及荧光标记技术检测ANA。如果血清中存在ANA，它们会与细胞核成分特异性结合。随后加入荧 光标记的抗人球蛋白抗体（以下简称二抗），该抗体会与ANA 结合，从而在荧光显微镜下观察到绿色荧 光，表明ANA 的存在。 5.2 检测方法 IIF 法是检测抗核抗体的参考方法。采用IIF 法检测时宜满足以下条件： a) 在HEp-2 实验基质中，每显微镜视野（放大倍数为200 倍）可见3 个～5 个有丝分裂细胞； b) 二抗使用荧光素标记的抗人IgG 抗体； c) 样本稀释方法可根据不同的检测试剂而采用10稀释系统或倍比稀释系统。 6 开展前准备工作 6.1 性能验证 在开展IIF-ANA 检测前宜进行性能验证，验证内容包括但不限于： a) 符合率； b) 精密度（重复性）； c) 检出限； d) 临界值； e) 抗干扰能力。 6.2 人员培训 实验操作以及结果判读的人员宜参加培训并通过考核、获得相关授权后方可独立工作。培训的内容 包括但不限于： a) 实验基本原理和操作步骤； b) 仪器和显微镜的操作、维护保养和处理一般性故障； c) 质量控制及失控处理； d) 荧光模型判读及相关抗体临床意义； e) 试剂更换批号比对。 6.3 仪器校准 仪器校准内容包括但不限于： a) 加样体积的准确性和精密度在仪器说明书规定的范围内； b) 携带污染率评估； c) 显微镜及CAD 的光强度，宜采用荧光显微镜校准玻片或光功率计校准，结果在仪器说明书规定 的范围内； d) 至少每年校准1 次，对于使用频次高的仪器，宜增加校准频率。 6.4 制定SOP 6.4.1 SOP 包括但不限于下列内容： T/CITS 179—2024 3 a) 项目信息：项目名称、检测原理及方法、试剂、荧光显微镜、自动化仪器（如使用自动荧光制 片机、CAD）等； b) 样本要求：检测样本类型及储存要求； c) 室内质控程序及可接受标准； d) 实验操作步骤：具体实验步骤（手工和仪器）和注意事项等； e) 项目性能参数：符合率、精密度、检出限、临界值和抗干扰能力等； f) 结果报告：结果解释、临床意义、备注信息等； g) 其他信息：荧光片保存条件（试剂保存及完成的荧光载片保存条件）等。 6.4.2 如果使用自动化仪器（自动化荧光制片机、CAD），其SOP 的内容在满足6.4.1 所列内容基础上 还包括但不限于： a) 仪器校准要求； b) 仪器操作步骤及维护保养； c) 常见故障及处理措施。 7 IIF-ANA 检测操作 7.1 检验前 检验前完成的内容包括： a) 确认环境温湿度符合检测体系的要求，室温宜为18 ℃～25 ℃，湿度宜为30％～70％； b) 测试样本和试剂平衡至室温，荧光片进行室温平衡时不宜从包装的铝膜中拆出； c) 按试剂说明书配制缓冲液，并充分混合。 注：如果使用自配缓冲液，建议考虑缓冲液的pH 值为7.2～7.4。 7.2 检验中 检验中的操作包括： a) 每批实验宜有血清基质的质控品； b) 加样时加样枪不宜接触到细胞，不宜产生气泡，液体宜覆盖整个孔，且不外溢到相邻孔中； c) 洗片时，不宜将洗液直接对着孔内冲洗，避免损伤基质上包被的细胞和组织； d) 加荧光二抗前，宜去除荧光片上多余的洗液； e) 观察玻片的疏水性，保持荧光片上的试剂呈液滴状态，避免液体散开并外流至其他孔中； f) 实验过程中手指避免触碰荧光片的基质； g) 封片时，孔内不宜有气泡产生； h) 完成实验后，宜立刻读片；如不能立即读片，宜按荧光片要求的保存条件进行保存； i) 实验过程由全自动仪器完成时，实验过程中宜确保每个样本孔的样本及试剂加样准确；实验过 程洗液宜充足，没有干片现象。 7.3 结果判读 7.3.1 结果判读宜在显微镜下进行操作。使用光源为汞灯的显微镜时，在接通电源后宜预热10min～ 15min，汞灯电源开、关时间宜间隔30min 以上。使用光源为LED 灯的显微镜时即开即用。宜定期维护 保养显微镜，记录显微镜每次使用时长，到达使用寿命宜及时更换。 7.3.2 结果判读宜包括以下内容： a) 只有在质控结果符合要求的情况下，才可进行结果判读； b) 低倍镜（20 倍物镜）用于判读阴阳性结果，高倍镜（40 倍物镜）用于判读荧光模型； c) 采用CAD 的实验室，判读结果由读片人员复核后进行报告； d) 结果判读宜“双人双核”，结果不一致时由两人讨论后进行结果报告； e) 若手工记录判读结果录入信息系统，宜双人核对，准确录入结果。 7.4 结果报告 7.4.1 IIF-ANA 检测结果报告宜包括： T/CITS 179—2024 4 a) 检测方法； b) 定性结果（阳性/阴性）； c) 荧光模型； d) 阳性结果的滴度； e) 必要的临床建议。 7.4.2 IIF-ANA 检测结果报告格式范例见表1。 表1 IIF-ANA 检测结果报告范例 序号报告内容 1 检测结果：阴性 检测方法：间接免疫荧光法 建议：无 2 细胞核阳性 荧光模型包括：核均质型、核颗粒型、致密细颗粒型、着丝点型、核点型、核仁型、核膜型和核 多形性型等 检测结果：阳性。荧光滴度：1:100/320/1000/3200/10000 或1:80/160/320/640/1280/2560 或（依 据各实验室采用的试剂厂家推荐的滴度系统报告） 检测方法：间接免疫荧光法 建议：如果临床怀疑SLE、SS、SSc、MCTD 或PM/DM 等，考虑进一步检测疾病相关抗体 3 细胞胞浆阳性 荧光模型包括：胞浆纤维型、胞浆颗粒型、胞浆网状/线粒体样型、胞浆极性/高尔基体样型和胞 浆棒环状型 检测结果：阳性。荧光滴度：1:100/320/1000/3200/10000 或1:80/160/320/640/1280/2560 或（依 据各实验室采用的试剂厂牌推荐的滴度系统报告） 检测方法：间接免疫荧光法 建议：如果临床怀疑SLE、AILD 或PM/DM 等，考虑进一步检测疾病相关抗体 4 细胞有丝分裂期核型阳性 荧光模型包括：中心粒型、纺锤体型、中间体型、染色体型 检测结果：阳性。荧光滴度：1:100/320/1000/3200/10000 或1:80/160/320/640/1280/2560（依 据各实验室采用的试剂厂家推荐的滴度系统报告） 检测方法：间接免疫荧光法 建议：临床相关性不明 5 混合荧光模型阳性：参照：2、3 和4，荧光模型的报告优先级顺序为细胞核荧光模型、细胞浆荧 光模型、细胞有丝分裂期荧光模型。相同优先级的荧光模型，宜按滴度高低顺序依次报告 检测结果：阳性。荧光滴度：1:100/320/1000/3200/10000 或1:80/160/320/640/1280/2560（依 据各实验室采用的试剂厂家推荐的滴度系统报告） 检测方法：间接免疫荧光法 建议：参照2、3 和4，根据荧光模型进行相应建议 7.4.3 混合荧光模型的报告优先级顺序为细胞核荧光模型、细胞浆荧光模型、细胞有丝分裂期荧光模 型，相同优先级的模型宜按滴度高低顺序依次报告。 7.4.4 HEp-2 细胞核、细胞胞浆及细胞有丝分裂期荧光模型宜纳入ANA 阳性结果。 7.4.5 针对靶抗原特异性自身抗体检测结果，报告宜包括检测方法、检测结果、参考区间及必要的临 床建议。 8 质量控制 8.1 室内质控 T/CITS 179—2024 5 8.1.1 室内质控品包括阴性、阳性/弱阳性2 个水平，可使用商品化的质控血清或自制血清作为室内质 控品。不宜仅采用商品化试剂盒中自带的阴阳性对照品作为实验检测的室内质控品。 8.1.2 自制室内质控品可采用ANA 检测阴性、弱阳性、阳性混合血清或来源于单一患者的血清作为室 内质控品，充分混匀分装后对自制质控品进行均一性和稳定性验证。 8.1.3 质控结果同时满足以下条件则表明室内质控品结果符合要求： a) 阴性、阳性一致； b) 阳性质控荧光模型一致； c) 阳性质控品的滴度在靶值±一个滴度范围内。 8.2 室间质评 宜参加卫生主管部门组织的室间质评。如果室间质评中未涉及的必报荧光模型，宜定期（一年两次） 进行实验室间比对。 8.3 数据总结 宜计算过去12 个月ANA 阳性率的均值，确立变异系数（coefficient of variation，CV），并根 据临床符合率/一致性进行总结。 9 ANA 检测的临床应用 9.1 自身免疫性疾病的诊断 ANA 检测可作为自身免疫性疾病的诊断依据。ANA 在常见自身免疫性疾病的阳性率见表2。 表2 常见自身免疫性疾病的ANA阳性检出率 疾病ANA阳性率 SLE 95% MCTD 95%～100% RA 20%～30% SS 60%～70% SSc 80%～90% PM/DM 30% AILD 10%～15% 注：RA是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis） 9.2 病情监测与疗效评估 ANA 检测结果以辅助诊断为目的，不宜作为疾病活动度评估或治疗反应监测指标。 T/CITS 179—2024 6 参考文献 [1] GB 40265—2021 酶免疫检测抗体检测通则 [2] 中国医师协会风湿免疫科医师分会自身抗体检测专业委员会. 抗核抗体检测的临床应用专家 共识[J]. 中华检验医学杂志，2018，41（4）：275-280 [3] 中国中西医结合学会检验医学专业委员会，上海市医学会检验医学专科分会. 间接免疫荧光 法用于抗核抗体实验室检测的中国专家共识[J]. 中华检验医学杂志，2023，46（11）：1149-1163 [4] 李金明.抗核抗体的检测程序与结果报告及解释[J].中华检验医学杂志，2009，32（12）： 1325-1328 [5] 李金明，刘辉. 临床免疫学检验技术. 北京：人民卫生出版社，2015 [6] 尚红，王兰兰. 实验诊断学. 北京：人民卫生出版社，2015