T/SAASS 332-2026 豌豆基因编辑技术体系构建技术规程

　　ICS 65.020.01 CCS B 05

　　SAASS

　　团 体 标 准

　　T/SAASS 332—2026

　　豌豆基因编辑技术体系构建技术规程

　　Technical code of practice for establishing gene editing system in pea

　　2026 - 02 - 11 发布 2026 - 02 - 11 实施

　　山东农学会 发 布

　　T/SAASS 332—2026

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由山东省农业科学院提出。

　　本文件由山东农学会归口。

　　本文件起草单位：山东省农业科学院、盐碱地综合利用技术创新中心。

　　本规程起草人：李冠、李娜娜、贾凯华、杨永义、李润芳、田汝美、刘敏、白静、谢坤、宫永超。

　　I

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　　豌豆基因编辑技术体系构建技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了豌豆基因编辑技术体系构建的试验平台条件、体系构建准备、体系构建流程和档案管理技术要求。

　　本文件适用于采用CRISPR/Cas基因编辑技术开展豌豆基因功能研究、基因编辑育种相关研究、材料创制及技术操作。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 19489 实验室 生物安全通用要求

　　GB/T 27428 植物生物安全实验室通用要求

　　GB/T 46433.1 生物技术 基因组编辑 第1部分:术语

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　A. Rhizogenes：根瘤菌(Agrobacterium rhizogenes)

　　bp：碱基对(Base Pair)

　　Cas9：CRISPR 关联基因编码的蛋白(CRISPR associated 9)

　　CRISPR：成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)

　　U6 snRNA：小核 RNA(small nuclear RNA)

　　DH5 α：一种大肠杆菌菌株，常用于分子克隆实验，是一种高效的 DNA 转化宿主。

　　DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

　　E. Coli：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

　　Golden Gate：一种基因组拼接技术，通过限制性内切酶和 DNA 连接酶高效拼接多个 DNA 片段。

　　Hi-TOM：用于高通量突变检测的在线工具，主要用于基因编辑后的突变鉴定。

　　K599：一种根瘤菌菌株，广泛用于植物转基因实验中的基因导入。

　　NGG：PAM 序列中的常见三核苷酸(N 表示任何碱基，G 是鸟嘌呤)

　　OD600 ：600 nm 波长下的光密度(Optical Density at 600 nm)

　　PAM：识别序列(Protospacer Adjacent Motif)

　　PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)

　　sgRNA：单链引导 RNA(Single Guide RNA)

　　sgRNA scaffold：sgRNA 支架结构，是 CRISPR/Cas9 系统中引导 RNA 的一个部分，帮助保持其结构功能。

　　tRNA：转运 RNA(Transfer RNA)

　　1

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　　TY：胰蛋白胨和酵母提取物组成的一种培养基(Tryptone and Yeast extract)，用于微生物的培养。

　　5 基本要求

　　5. 1 实验场所

　　实验场所及设施应符合GB 19489、GB/T 27428及植物基因工程相关生物安全管理规定。

　　5.2 仪器设备

　　所需仪器设备包括PCR仪、核酸电泳与凝胶成像系统、超微量分光光度计、高速离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台及高压灭菌锅。用于豌豆无菌苗和转化材料培养的设施应具备温度、光周期及湿度可调控功能。

　　6 体系构建准备

　　6. 1 植物材料

　　选用适合进行农杆菌转化的豌豆品种或其他合适的基因型材料。

　　6.2 菌株

　　E. Coli DH5α用于质粒克隆与扩增;A. rhizogenes K599用于豌豆遗传转化，见附录A.1。

　　6.3 载体

　　包含Cas9表达单元及sgRNA表达骨架的模块化载体，见附录A.2。

　　6.4 酶与主要试剂

　　所需主要试剂包括分子生物学常用酶制剂、核酸纯化试剂、突变检测试剂盒、植物基因组DNA提取试剂，以及植物培养所需的培养基及相关添加剂，见附录A.3、A.4和A.5。

　　7 体系构建流程

　　7. 1 U6 启动子的筛选与克隆

　　通过序列同源比对在豌豆基因组中鉴定内源U6 snRNA基因，选取其转录起始位点上游600 bp区域作为候选启动子序列，并设计特异性引物对候选内源U6启动子进行克隆。采用高保真PCR扩增目标片段，经凝胶纯化后连接至平端克隆载体，转化DH5α, 并通过抗性筛选、菌落PCR、限制性酶切及测序分析验证获得正确克隆。

　　7. 2 中间载体的构建

　　基于验证正确的内源U6启动子，采用酶切连接方法分别将U6启动子与sgRNA scaffold连接，构建sgRNA表达单元，并将其克隆至含Cas9表达框的双元载体中形成sgRNA表达中间载体。通过抗性筛选、PCR扩增、限制性酶切及测序分析对载体构建的正确性进行验证。

　　7. 3 靶向载体的构建

　　根据目标基因序列设计满足PAM为NGG的特异性sgRNA表达盒，同时利用tRNA-sgRNA融合表达策略以提高基因编辑效率。采用Golden Gate组装方法，将sgRNA表达盒组装至sgRNA表达中间载体中，构建基因编辑靶向载体，并将其转化至发根农杆菌K599感受态细胞中，经检测验证获得阳性转化子。

　　7,4 瞬时遗传转化

　　挑选饱满干净、生长状态好的豌豆种子平铺在无菌培养皿中，将放置豌豆的培养皿放在密封状态良好的干燥器中，将300 mL次氯酸钠溶液放在500 mL的小烧杯中，并将小烧杯放在干燥器内，移液枪取20

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　　mL浓盐酸加入放有次氯酸钠溶液的烧杯中，并迅速盖好干燥器的盖子，密闭消毒10h～12h。将消毒后的豌豆种子接种于萌发培养基，在25℃条件下、16 h光照/8 h黑暗的培养环境中培养约7 d～10 d获得无菌苗;发根农杆菌经活化后，于含相应抗生素的TY液体培养基中，在28℃、200 rpm条件下振荡培养至菌液OD600为约0.6～0.8。取无菌苗子叶节并保留约3 mm～5 mm下胚轴作为外植体，置于侵染液中侵染约30 min。侵染后将外植体转入共培养培养基，在28℃黑暗条件下共培养约4 d;共培养结束后，经含羧苄青霉素和头孢霉素的清洗液洗涤，转入毛状根诱导培养基，在28℃黑暗条件下培养约3周，并每约10 d更换一次新鲜的诱导培养基，以诱导毛状根形成，见附录A.5。

　　7.5 突变检测与分析

　　从毛状根材料中提取基因组DNA，针对各编辑靶位点设计特异性引物，对目标区域进行PCR扩增，扩增片段长度控制在180 bp～250 bp。采用Hi-TOM试剂盒对PCR产物开展高通量测序，将各样本测序数据与参考序列进行比对分析，鉴定插入和缺失等突变类型。各靶点的编辑效率按式(1)进行计算：

　　A ········································································· (1)

　　式中：

　　A——编辑效率;

　　B——发生编辑的有效测序序列数;

　　C——总有效测序序列数。

　　7.6 基因编辑高效性判定标准

　　基因编辑系统高效性的评价原则和方法按照GB/T 46433.1的规定执行。根据目标位点的突变类型和编辑效率对基因编辑系统的效率水平进行分级判定，分级标准见表1。

　　表1 编辑效率分级标准表

　　效率等级

　　编辑效率A

　　突变类型特征说明

　　高效

　　A≥50

　　以插入和缺失等靶向突变为主，突变类型清晰且一致性较好

　　中等

　　20≤A<50

　　可检测到明确的靶向突变，但不同转化事件间效率存在一定差异

　　低效

　　5≤A<20

　　靶向突变比例较低，突变类型分散

　　极低效或无效

　　A<5

　　未检测到稳定的靶向突变或突变比例极低

　　7.7 体系构建流程图

　　豌豆基因编辑技术体系构建流程图见图 1。

　　3

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　　图1 豌豆基因编辑技术体系构建流程图

　　8 档案管理

　　建立体系构建档案，档案内容主要记录植物材料，酶与主要试剂，载体构建流程，编辑效率结果分析等，档案保存2年以上。

　　4

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　　附 录 A

　　(规范性)

　　常用菌株、载体、关键酶和生化试剂、核酸操作试剂盒以及培养基菌株类别、名称、用途、抗性标记和保存条件见表A.1。

　　表A.1 菌株的用途、抗性标记及保存条件

　　类别

　　名称

　　用途

　　抗性标记

　　保存条件

　　大肠杆菌

　　E.coli DH5α

　　质粒克隆与扩增

　　卡那霉素

　　-80℃甘油保藏;4℃短期保存

　　根癌农杆菌

　　A.rhizogenes

　　K599

　　发根遗传转化

　　链霉素及卡那霉素

　　-80℃甘油保藏

　　常用的载体及其特征和用途见表A.2。

　　表A.2 载体的特征和用途

　　名称

　　特征

　　用途

　　pHUN 4c01

　　克隆载体，含AtU6p26序列

　　提供AtU6p26启动子模板

　　pHUC411

　　克隆载体，含OsU3p序列

　　提供OsU3p启动子模板

　　GmU6-10-SpR-sg2.0 in PUC57

　　重组质粒，含GmU6p10序列

　　提供GmU6p10启动子模板

　　T-SpR

　　中间载体

　　用于构建sgRNA表达单元

　　pHUC-en35s-PsCas9-t35sT

　　双元载体，含豌豆密码子优化的Cas9

　　基因

　　CRISPR/Cas9系统的核心表达载体

　　pEASY-Blunt Simple Cloning Vector

　　平端克隆载体

　　PCR产物克隆

　　常用的关键酶和生化试剂见表A.3。

　　表A.3 关键酶与生化试剂的说明、来源及保存条件

　　类别

　　名称

　　说明

　　保存条件

　　PCR相关

　　TransStart® FastPfu Fly PCR SuperMix

　　高保真PCR预混液

　　-20℃保存

　　2×EasyTaq® PCR Supermix

　　常规PCR预混液，用于菌落

　　PCR

　　-20℃保存

　　克隆与酶切

　　NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix

　　无缝克隆试剂

　　-20℃保存

　　限制性内切酶(Pst I，Sal I，Hind III，

　　EcoR I，Bsa I)

　　FastDigest系列，快速酶切

　　-20℃保存

　　T4 DNA Ligase

　　DNA连接酶

　　-20℃保存

　　CutSmart Buffer

　　通用缓冲液

　　-20℃保存

　　生化试剂

　　乙酰丁香酮(AS)

　　农杆菌转化诱导剂

　　-20℃保存

　　二硫苏糖醇(DTT)

　　抗氧化剂

　　-20℃保存

　　氨苄青霉素(Amp)

　　抗生素，工作浓度100mg/L

　　-20℃保存

　　奇霉素/壮观霉素(Spec)

　　抗生素，工作浓度100mg/L

　　-20℃保存

　　卡那霉素(Kan)

　　抗生素，工作浓度100mg/L

　　-20℃保存

　　羧苄青霉素(Carb)

　　抗生素，工作浓度250mg/L

　　-20℃保存

　　头孢霉素(Cef)

　　抗生素，工作浓度250mg/L

　　-20℃保存

　　核酸操作和突变检测的试剂盒见表A.4。

　　表A.4 核酸操作与检测试剂盒用途和来源

　　名称

　　用途

　　AxyPrep DNA Gel Extraction Kit

　　DNA凝胶回收

　　AxyPrep Plasmid Miniprep Kit

　　质粒小量提取

　　Hi-TOM高通量测序试剂盒

　　编辑突变检测

　　5

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　　用于细菌和植物组织培养的培养基及其主要成分见表A.5。

　　表A.5 培养基组分及用途

　　名称

　　主要成分

　　用途

　　LB培养基

　　胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉(固体)

　　大肠杆菌培养

　　TY培养基

　　胰蛋白胨、酵母提取物

　　农杆菌培养

　　萌发培养基

　　Murashige and Skoog基础盐(含维生素) 、蔗糖、植物凝胶、6-BA

　　豌豆种子萌发

　　侵染液

　　Murashige and Skoog基础盐(含维生素) 、蔗糖、MES、AS、DTT

　　农杆菌侵染

　　共培养培养基

　　Murashige and Skoog基础盐(含维生素) 、蔗糖、MES、AS、琼脂粉

　　共培养

　　清洗液

　　Murashige and Skoog基础盐(含维生素) 、蔗糖、MES

　　共培养后外植体清洗

　　诱导培养基

　　1/2 MS基础盐(含维生素)、蔗糖、Carb、Cef、植物凝胶

　　毛状根诱导

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