T/CHATA 044-2024 膜集菌涂片抗酸染色技术与操作规范

　　团 体 标 准

　　T/CHATA 044—2024

　　膜集菌涂片抗酸染色技术与操作规范

　　Specification formembrane-concentrated bacilli smear and acid-fast staining

　　technology

　　2024-10-17 发布 2024-10-17 实施

　　中 国 防痨协会 发 布

　　前 言

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由湖南省天骑医学新技术股份有限公司、湖南省防痨协会、中国防痨协会共同提出。

　　本文件由中国防痨协会归口。

　　本文件起草单位：湖南省天骑医学新技术股份有限公司、湖南省防痨协会、中国防痨协会、湖南省胸科医院、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京胸科医院、江苏省疾病预防控制中心、南京市第二医院(江苏省传染病医院、南京市公共卫生医疗中心)、浙江省疾病预防控制中心、安徽省结核病防治研究所(安徽省胸科医院)、广州市胸科医院、佛山市第四人民医院、湖北省疾病预防控制中心、湖北省武汉金银潭医院、长沙市中心医院肺科医院、长春市传染病医院、沈阳市胸科医院、河南省疾病预防控制中心、贵州省疾病预防控制中心结防所、河北省胸科医院、吉林省结核病防治研究院(吉林省结核病防治科学研究院附属医院)、吉林省疾病预防控制中心(吉林省公共卫生研究院)、永州市中心医院、湖南省洪江市中医医院、惠州市职业病防治院(结核病防治研究所)。

　　本文件主要起草人：彭钧、谭云洪、成诗明、白丽琼、胡培磊、刘彬彬、刘海灿、夏辉、姜广路、竺丽梅、陈诚、 曾谊、陈彬、刘洁、包训迪、刘志辉、叶一农、林东子、周丽平、黄朝林、裴异、潘建华、孙雪娟、陈禹、徐吉英、李进岚、张建武、赵庆龙、王慧、李军、陈振华、 田亚玲、刘志东。

　　膜集菌涂片抗酸染色技术与操作规范

　　1 范围

　　本文件规定了膜集菌涂片抗酸染色技术操作流程和质量控制等。

　　本文件适用于各级各类结核病定点医疗机构、综合医疗卫生机构和基层医疗卫生机构等开展膜集菌涂片染色工作。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　WS 233—2017 病原微生物实验室生物安全通用准则

　　WS 288—2017 肺结核诊断

　　WS/T 442—2024 临床实验室生物安全指南

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　过滤膜集菌杯 bacilli filtration concentrated vessel

　　装载有过滤膜片的容器，用于对样本中的细菌或细胞进行富集。

　　3.2

　　吸附膜集菌杯 bacilli adsorption concentrated vessel

　　装载有吸附膜片的容器，用于对样本中的细菌或细胞进行富集。

　　3.3

　　消化灭活液 digestion and inactivation solution

　　一种含有次氯酸钠消毒剂(浓度>5%)和蛋白裂解剂的化学试剂，用于消化样本中黏液、细胞、杂菌等干扰成分，使消化后的样本具有流动性，并保留样本中结核分枝杆菌结构的完整性。

　　3.4

　　透明高分子膜 transparent polymer membranes

　　一种有机高分子聚合物材料,表面经过特殊处理，对抗酸杆菌具有吸附性，且透光性及折光率满足光学显微镜检查要求而制成的透明薄膜。

　　3.5

　　光媒液 modified optic media solution

　　一种无毒、无挥发、无色的特殊液体，与滤膜材料具有相同折光系数，可使滤膜呈现完全透明状态，用于膜过滤集菌涂片染色后显微镜检查。

　　3.6

　　参考品 reference materials

　　由灭活牛分枝杆菌、结核分枝杆菌共同组成的菌悬液。

　　注：具有典型抗酸杆菌染色性和形态特征及相对稳定的菌悬液浓度(抗酸杆菌含量约 50 万条/mL)。

　　4 膜集菌涂片抗酸染色技术

　　4.1 样本处理

　　4.1.1 适用样本

　　本技术适用于痰液及各种体液样本，尤其是细菌载量较低的临床样本。

　　4.1.2 消化灭活

　　采用消化灭活液将样本中的黏液、细胞、坏死组织及其他微生物等溶解，充分暴露抗酸杆菌，对抗酸杆菌进行灭活处理的同时保持样本良好的流动性，便于膜材料对样本中抗酸杆菌的吸附或过滤集菌。试验操作应符合 WS 233—2017 和 WS/T 442-2024 相关生物安全要求。

　　4.2 膜集菌涂片

　　4.2.1 概述

　　是一种通过负压或离心将经过前处理样本中分散的抗酸杆菌富集在膜片上直接用显微镜镜检的涂片方法。根据集菌膜材料和集菌方法不同，膜集菌技术分为过滤膜集菌技术和吸附膜集菌技术。工作原理及参数见附录 A。

　　4.2.2 过滤膜集菌

　　采用一种液体可以滤过，抗酸杆菌无法滤过的高分子膜的集菌技术。膜材料由纳米纤维制成，平均微孔直径在0.45 μm，确保抗酸杆菌不被滤出，并且能够被相等折光系数光媒液透明，满足显微镜检查要求。

　　4.2.3 吸附膜集菌

　　采用一种经过表面处理，对抗酸杆菌具有吸附性的透明高分子膜的集菌技术，通过离心将样本中抗酸杆菌均匀分布在膜片上。高分子膜应满足显微镜检查要求。

　　4.3 膜抗酸染色

　　对完成了集菌的过滤膜或吸附膜直接进行抗酸染色。抗酸染色过程在过滤膜集菌杯或吸附膜集菌杯中进行。

　　4.4 设备和材料

　　膜集菌涂片抗酸染色技术所需设备和材料清单见附录 B。

　　5 膜集菌涂片抗酸染色操作

　　5.1 操作流程

　　膜集菌涂片抗酸染色操作可利用半自动设备或全自动设备完成。操作流程示意图见附录C。

　　5.2 过滤膜集菌抗酸染色

　　5.2.1 样本处理及涂片

　　样本处理及涂片步骤如下：

　　a) 消化灭活：样本中加入 2 倍~4 倍于样本量的消化灭活液，混匀消化 30 min;

　　b) 湿膜：将过滤膜集菌杯装入制片染色机中，加注湿膜液 0.5 mL 进行湿膜;

　　c) 过滤集菌：将消化好的 5.0 mL～10.0 mL 样本加入滤过集菌杯中负压抽吸过滤完成集菌涂片。

　　5.2.2 染色

　　在制片染色机内手动或自动完成。染色步骤如下：

　　a) 初染：滴加石碳酸复红染液 1.0 mL ，作用 6 min;

　　b) 清洗：滴加清洗液 2.0 mL ，保持 2 s;

　　c) 脱色：滴加脱色剂 1.5 mL ，保持 30 s;

　　d) 清洗：滴加清洗液 2.0 mL ，保持 2 s;

　　e) 复染：滴加亚甲蓝复染液 1.0 mL ，复染 30 s;

　　f) 清洗：滴加清洗液 2.0 mL ，保持 2 s。

　　5.2.3 制片

　　制片步骤如下：

　　a)干膜：染色后，将过滤膜集菌杯自然或加热干燥;

　　b)贴片：对准已滴加光媒液的载玻片，用取片器将膜取下贴片，膜透明同步完成。

　　5.3 吸附膜集菌抗酸染色

　　5.3.1 样本处理

　　样品处理步骤如下：

　　a)消化灭活：样本中加入 2 倍~4 倍样本量的样本消化灭活液，混匀消化 30 min;

　　b)离心：取消化好的样本 3.0 mL～7.0 mL(5.0 mL 为宜)于离心集菌杯中，置于离心机中，使用 3700 g~4000 g 离心力(场)离心 5 min;

　　c) 固定：取出离心集菌杯，倾去上清液，置干片机内烘干膜片表面水分，滴加无水乙醇固定，倾去多余的无水乙醇。

　　5.3.2 染色

　　染色步骤如下：

　　a)初染：滴加石碳酸复红染液 10 滴～15 滴，置于 60℃干片机内热染 5 min;

　　b)清洗：小量流水沿离心集菌杯杯壁轻轻冲洗，洗去染色液;

　　c)脱色：滴加脱色剂 10 滴～15 滴，脱色 30 s～60 s ，脱色至无可视红色为止;

　　d)清洗：小量流水沿离心集菌杯杯壁轻轻冲洗，洗去脱色液;

　　e)复染：滴加亚甲蓝复染液 10 滴～15 滴，复染 1min～3 min;

　　f)清洗：小量流水沿离心集菌杯杯壁轻轻冲洗，洗去染色液。

　　5.3.3 制片

　　制片步骤如下：

　　a)取片：用取片针将膜取出，吸水纸印干水分;

　　b)封片：菌膜向下贴于载玻片上，用中性胶封片。

　　6 阅片与报告

　　在光学显微镜或在全自动的光学显微镜下使用 100 倍油镜阅片;镜检报告按照 WS 288

　　—2017 所规定的涂片报告方式报告，并标注“膜集菌法 ”。

　　7 质量控制

　　7.1 样本处理

　　7.1.1 样本量：痰样本 3.0 mL～5.0 mL ，不少于 1.0 mL 。尿液、胸水、腹水、灌洗液、 胃液等样本量 20.0 mL～40.0 mL。

　　7.1.2 样本处理：按照 2 倍~4 倍痰样本量加入消化液消化作用 30 min ，若为脓样、干酪样痰样本适量增加消化灭活液比例和延长消化时间确保样本消化彻底;尿液、胸水、腹水、灌洗液、胃液等样本离心取沉淀物加消化灭活液处理;脑脊液、穿刺液、脓液等样本量较小的样本直接加消化灭活液。应保证样本充分消化，呈现良好流动性，便于过滤膜或吸附膜集菌，消化灭活后的样本一周内使用不会影响检验结果。

　　7.2 制片染色

　　7.2.1 每批次检测应同步检测参考品和阴性对照。

　　7.2.2 如同一批测试发现多个样本片有大量黑色颗粒物，需考虑染色液是否发生沉淀失效，要及时更换新的抗酸染色试剂。

　　7.2.3 过滤膜集菌完成后应对光观察膜面是否有破损，若存在破损且阅片结果为阴性，宜重新制片，若结果为阳性可直接报告。

　　7.2.4 完成染色后膜片应充分干燥，残留水分会影响膜片透明效果，干扰观察。

　　7.3 阅片

　　7.3.1 显微镜光源应优先采用卤素灯光源，LED 光源下观察抗酸杆菌呈现紫黑色，容易发生误判。

　　7.3.2 过滤膜集菌由于膜材料表面无法达到载玻片的平整度，镜检时需要不断微调显微镜微调进行观察， 以免漏检。

　　7.4 人员培训

　　对参加相关检测工作人员定期进行培训和能力评估。

　　附录 A

　　(资料性)

　　膜集菌涂片抗酸染色工作原理和参数

　　A.1 膜集菌涂片抗酸染色工作原理

　　用痰样本直接涂片抗酸染色发现抗酸杆菌是诊断结核病的重要手段，在痰样本抗酸杆菌较少时，这种方法检出率严重偏低。主要原因是直接涂片样本用量较少，仅约 0.05 mL,加上样本中包括大量黏液、细胞、杂菌等干扰成分，易导致痰样本直接涂片镜检假阴性，在临床诊断时发挥作用有限。膜集菌涂片技术克服直接涂片法缺陷，增加样本使用量，消化溶解干扰成分，提高检出率。

　　膜集菌涂片技术首先通过一种含有次氯酸钠消毒剂(浓度>5%)和蛋白裂解剂的化学试剂对样本进行处理，可消化样本中黏液、细胞、杂菌等干扰成分，确保富含脂质成分的抗酸杆菌结构完整，并保证作用后的液体具有良好的流动性，同时灭活抗酸杆菌，提高了实验室的生物安全性。处理后的样本通过过滤膜集菌杯或吸附膜集菌杯在专用设备上对液体中抗酸杆菌进行过滤集菌或吸附集菌。并在膜材料上直接进行抗酸染色，直接取膜材料在载玻片上贴片完成镜检。

　　过滤膜集菌杯滤膜由纺丝纳米纤维制成，平均孔径 0.45 μm，确保截留样本中抗酸杆菌，其材料折光系数与光媒液相同，可被完全透明适合光学显微镜观察。

　　吸附膜集菌杯吸附膜由高分子透明材料制成，表面经过特殊处理，在离心力作用下可有效吸附液体中的抗酸杆菌，吸附膜厚度及折光系数适合光学显微镜观察。

　　A.2 膜集菌涂片参数

　　A.2.1 集菌倍数

　　指采用膜集菌涂片使用的痰样本实际使用量与直接涂片使用痰样本量的比例。直接涂片痰样本量约为 0.05mL，采用膜集菌痰样本实际使用量应大于或等于 1.0 mL，集菌倍数大于或等于 20。

　　指标意义：样本量过少时影响集菌效果。

　　A.2.2 抗酸杆菌灭活效果

　　指室温条件下按照留取的痰样本量加入 2 倍～4 倍的样本消化灭活液，混匀消化 30min，可灭活样本中可能存在的抗酸杆菌。阳性样本经过灭活后采用固体培养或液体培养，无抗酸杆菌生长。

　　指标意义：确保检测工作人员在操作过程中的生物安全性。

　　A.2.3 分析灵敏度(检测限)

　　膜集菌涂片的最低检测浓度为痰样本中 2000 条/mL 抗酸杆菌。

　　指标意义：提高阳性检出率。

　　附录 B

　　(资料性)

　　膜集菌涂片抗酸染色技术设备和材料

　　过滤膜集菌抗酸染色和吸附膜集菌抗酸染色技术设备和材料分别见表 B.1 和表 B.2。

　　表 B.1 过滤膜集菌抗酸染色技术设备和材料

　　表 B.2 吸附膜集菌抗酸染色技术设备和材料

　　附录 C

　　(资料性)

　　膜集菌涂片抗酸染色操作流程示意图

　　膜集菌涂片抗酸染色操作流程示意图见图 C.1。

　　图 C.1 膜集菌涂片抗酸染色操作流程示意图

　　参考文献

　　[1] WS 196—2017 结核病分类

　　[2] 医疗卫生机构医疗废物管理办法 (卫生部令第 36 号)

　　[3] 医疗废物管理条例(国务院令第 380 号)

　　[4] 人间传染的病原微生物目录(国卫科教发〔2023〕24 号)

　　[5] 赵雁林，逄宇.结核病实验室检验规程[M].北京：人民卫生出版社.2015.

　　[6] Paul D C, Ngeow Y F, Yap S F, et al. Concentrated specimen smear microscopy utilising a polymer membrane sandwich filtration vessel for the detection of acid-fast bacilli in health facilities in Sabah, East Malaysia[J]. Tuberculosis, 2022, 133 : 102183.

　　[7] Xia H, Yuan Y, Zhang T, et al. Multicenter evaluation of membrane-based smear microscopy for detecting acid-fast bacilli in China [J]. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 2018, 11 (11) : 5459.