NY/T 4895-2025 西番莲(百香果)脱毒种苗生产技术规程

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4895—2025

　　西番莲(百香果)脱毒种苗生产技术规程

　　Technical code for virus-free plantlet production of

　　passion fruit (Passiflora edulis)

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　NY/T 4895—2025

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部农垦局提出 .

　　本文件由农业农村部热带作物及制品标准化技术委员会归 口 .

　　本文件起草单位 : 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 、中国热带农业科学院热带生物技术研究所 、广西壮族自治区农业科学院 、福建省农业科学院果树研究所 、三亚碧兰春花卉发展有限公司 、海南美丽乡村果业有限公司 .

　　本文件主要起草人 :邢文婷 、宋顺 、黄东梅 、吴斌 、王健华 、许奕 、杨柳 、应东山 、魏秀清 、韦晓霞 、马伏宁 、蒋萍 、蒋邦增 、赵军涛 .

　　西番莲(百香果)脱毒种苗生产技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了西番莲(百香果 , Passiflora edulis)脱毒种苗生产技术的术语和定义 、脱毒组培苗培养 、脱毒组培苗驯化 、脱毒种苗繁育 、种苗质量 、包装储运和育苗档案等要求 .

　　本文件适用于西番莲(百香果)紫果和黄果品种及其杂交种的脱毒种苗生产 .

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件 .

　　GB/T 8321 (所有部分) 农药合理使用规则

　　GB/T 42478 农产品生产档案记载规范

　　NY/T 525 有机肥料

　　NY/T 1276 农药安全使用规范 总则

　　NY/T 2517 植物新品种特异性 、一致性和稳定性测试指南 西番莲

　　NY/T 3972 西番莲 种苗

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件 .

　　3 .1

　　特定病毒 specificvirus

　　黄瓜花叶病毒(CMV) 、夜 来 香 花 叶 病 毒 (TeMV) 、西 番 莲 木 质 化 病 毒 (PWV) 、东 亚 西 番 莲 病 毒(EAPV) 、西番莲大戟曲叶病毒(EuLCV) 、西番莲潜隐病毒(PLV) 、广东番木瓜曲叶病毒(PaLCuGDV) 7个西番莲常见病毒 .

　　3 .2

　　脱毒组培苗 virusG free tissueG cultured plantlet

　　经脱毒处理且无特定病毒的组培苗 .

　　3 .3

　　生物隔离大棚 biologicalisolation greenhouse

　　配备 60 目以上防虫网 、通风系统 、遮阳和喷雾系统等设施大棚 .

　　3 .4

　　脱毒原种苗 virusG freepreG elitestock

　　在生物隔离大棚内 ,移栽成活的脱毒组培苗经病毒检测 ,确认不带特定病毒且性状稳定 、未经过代数繁殖的组培苗 .

　　3 .5

　　脱毒种苗 virusG freecertified seedling

　　在生物隔离大棚内 , 由脱毒原种苗生产出符合质量要求的脱毒嫁接苗或扦插苗 .

　　3 .6

　　定植 planting

　　在生物隔离大棚中将组培苗种植于含育苗基质的控根器中 .

　　4 脱毒组培苗培养

　　4 .1 外植体消毒

　　取经脱毒预处理后生长势旺盛的新梢 , 流水冲洗后用中性洗涤剂浸泡 15 min~ 20 min,再用流水冲洗干净后 ,切取长度 2 cm~ 3 cm 的新梢顶芽为外植体 ,并在无菌环境下用 75%酒精浸泡 45 s,无菌水冲洗 2 次 ,用含 0 .1%吐温(Tween20)的 0 .5% ~ 1 .0%次氯酸钠溶液浸泡 5 min~ 15 min或 0 .1% ~0 .15% HgCl2 溶液浸泡 5 min~ 8 min,无菌水洗 4 次 ~ 5 次 。

　　4 .2 外植体无菌体系

　　4 .2 .1 无菌外植体筛选

　　取 4 .1 外植体的茎尖 ,长度 ≤1 .0 cm ,在 MS培养基上培养 10 d~ 15 d,筛选无污染的茎尖。

　　4 .2 .2 培养条件

　　昼/夜温度(26 ℃ ~ 30 ℃)/(21 ℃ ~ 25 ℃) ,光照强度 2 500 lx~ 3 200 lx,昼/夜(16 h/8 h) 。

　　4 .3 茎尖脱毒培养

　　4 .3 .1 腋芽诱导

　　将 4 .2 茎尖接种至含植物细胞分裂素的腋芽启动培养基中诱导腋芽生长 ,培养条件见 4 .2 .2;对每个腋芽进行编号。 腋芽萌发培养基相关信息见附录 A 中的 A.1 。

　　4 .3 .2 二次茎尖培养

　　切取腋芽的茎尖 ,长度≤0.5 cm,接种至增殖培养基上培养。 培养条件 : (25±1) ℃ ,光照强度 3 000 lx~

　　注 :每个茎尖编写品种 、茎尖号 、接种 日期。

　　4 .3 .3 继代培养

　　将 4 .3 .2 培养材料切成带芽茎段 ,每 30 d~45 d更换一次新培养基 , 同一个腋芽的培养材料为同一个芽系 ,统一编号 ,继代培养 4 次 ~ 5 次 ,培养条件见 4 .2 .2;对不同芽系材料进行病毒检测 ,将检测无特定病毒的材料进一步培养。

　　4 .3 .4 生根诱导培养

　　选取嫩茎长度≥1.5 cm 的单芽 ,在含植物生长素的 MS培养基中诱导生根。培养条件 :温度(26±1) ℃ ,光

　　5 .1 炼苗

　　在生物隔离大棚内 ,选取主茎高 ≥3 .0 cm 的组培瓶苗 ,放置于 20 ℃ ~ 30 ℃温度下闭瓶炼苗 7 d~ 14 d,接着揭盖 50%炼苗 2 d~ 3 d。

　　5 .2 移栽

　　在生物隔离大棚内 ,流水冲洗组培苗基部培养基 ,移栽到育苗基质中 ,用塑料薄膜和遮阳网保湿 、遮阳

　　20 d~ 30 d,保持温度 26 ℃ ~ 28 ℃ , 空气相对湿度 70% ~ 85% 。对移栽成活的组培苗进行特定病毒检

　　测 ,检测方法见附录 B。

　　5 .3 定植

　　将 5 .2 检测无特定病毒的组培苗定植于含育苗基质的控根器中。 对定植之后的组培苗按照 NY/T 2517

　　的规定进行稳定性鉴定 ,获得性状稳定的组培苗即为脱毒原种苗。

　　5 .4 驯化条件

　　5 .4 .1 生物隔离

　　生物隔离大棚应减少人员出入 ,周边应无十字花科 、茄科及其他易引诱蚜虫 、橘小实蝇 、蓟马和粉虱的作物。

　　5 .4 .2 基质

　　选用含泥炭土 、蛭石 、珍珠岩主要成分的混合材料或其他满足脱毒组培苗正常生长的基质。

　　5 .4 .3 基质及器具消毒

　　用 0 .5 g/L~ 2 .0 g/L 的 50%多 菌 灵 可 湿 性 粉 剂 、甲 基 托 布 津 800 倍 ~ 1 000 倍 液 或 经 121 ℃ 、 105 kPa条件下消毒 30 min。

　　6 脱毒种苗繁育

　　6 .1 嫁接繁育

　　6 .1 .1 砧木培育

　　采集抗根腐 、茎基腐病品种的种子 ,嫁接前 2 个 ~ 3 个月在育苗基质中播种 , 当实生苗叶片达到6 片 ~ 10 片叶 ,茎粗为 2 .5 mm~ 3 .5 mm 时 ,切除顶端 ,作为嫁接砧木备用。

　　6 .1 .2 穗条准备

　　在生物隔离大棚内 , 以脱毒原种苗为母本 ,选择带 1 个 ~ 2 个饱满叶芽的新梢和半木质化枝条作为穗条 。母本园每半年病毒检测 1 次 ,每株一年内至少被抽检 1 次 。

　　6 .1 .3 嫁接培育

　　选择直径为 2 .0 mm~ 3 .0 mm 的穗条 ,剪成 5 .0 cm~ 7 .0 cm 的新梢或茎段作为接穗 ,在下端离下芽眼 4 .0 cm 以上 ,削成 1 .0 cm~ 2 .0 cm 的楔形切 口 ,插入对应纵切深度的砧木中 ,用嫁接夹或嫁接套管固定 、愈合 ,保持环境温度 26 ℃ ~ 33 ℃ ,前期(7 d~ 10 d)保持空气相对湿度 85% ~ 95% , 10 d 之后相对湿度为 50% ~ 70% 。

　　6 .2 扦插繁育

　　6 .2 .1 插条准备

　　本园每半年病毒检测 1 次 ,每株一年内至少被抽检 1 次 。

　　6 .2 .2 扦插培育

　　在生物隔离大棚内 ,将 6 .2 .1 半木质化插条切成 10 cm~ 15 cm 带芽茎段 ,在下端的最低端 1 .0 cm~ 2 .0 cm 处 ,斜切成(1 .0±0 .1) cm 的切 口 ,顶端侧芽处留 1/3 ~ 1/2 叶片 ,经含 IBA、IAA、NAA 等生根剂处理 ,扦插于消毒的育苗基质中 ,保持温度 26 ℃ ~ 28 ℃ ,空气相对湿度 80% ~ 95% 。

　　6 .3 育苗管理

　　6 .3 .1 水肥管理

　　脱毒原种苗浇灌用水应采用经过滤处理的天然水或自来水 ,所使用的有机肥料应符合 NY/T 525 的相关规定。 脱毒种苗灌溉用水和施肥与常规管理相同 ,并注意及时排水。

　　6 .3 .2 病虫害防治

　　根据病虫害情况 ,选择高效低毒的药剂防治 ,使用农药应符合 GB/T 8321 和 NY/T 1276 的要求。 隔

　　离棚内种苗常见病虫害防治方法见附录 C。

　　7 种苗质量

　　7 .1 基本要求

　　脱毒种苗应符合 NY/T 3972 扦插苗 、嫁接苗的基本要求。

　　7 .2 分级指标

　　脱毒嫁接苗 、扦插苗的分级指标按照 NY/T 3972 的规定执行。

　　7 .3 病毒检测

　　格的应立即移除 .

　　8 包装储运

　　8 .1 包装

　　应用洁净 、透气性好 、无带孔的硬纸箱或其他材料包装 .

　　8 .2 储运

　　种苗储存与运输应按 NY/T 3972 的规定执行 .

　　9 育苗档案

　　应按照 GB/T 42478 的相关规定建立育苗档案 ,其中记载内容包括品种名称 、来源 、数量 、生产者 、组织培养 、移栽驯化时间 、育苗时间 、病虫害及防治 、出圃 日期等 . 育苗档案保存 2 年以上 .

　　附 录 A

　　(资料性)

　　培养基配方与植物生长调节剂

　　A.1 不同组培阶段参考培养基

　　外植体腋芽萌发培养基 :MS+2 .0 mg/L 6__BA+0 .5 mg/L ZT+30 g/L 白砂糖 +6 .5 g/L琼脂粉 , pH 5 .8 ~ 6 .0 。

　　增殖 、继代培养基 :紫果 ,MS+0 .5 mg/L6__BA+0 .02 mg/LZT+ 30 g/L白砂糖 +6 .5 g/L琼脂粉 , pH 5 .8 ~ 6 .0;黄 果 , 1/2MS+ 1 .5 mg/L 6__BA+ 0 .03 mg/L ZT+ 0 .01 mg/L IBA+ 30 g/L 白 砂 糖 + 6 .5 g/L琼脂粉 ,pH 5 .8 ~6 .0;杂交种 ,MS+1 .5 mg/L6__BA+0.03 mg/LZT+0.05 mg/LIBA+ 30 g/L白砂糖 +6 .5 g/L琼脂粉 ,pH 5 .8 ~ 6 .0 。

　　生根培养基 :紫果 ,MS+3 .5 mg/LIBA+15 g/L 白砂糖 +6 .5 g/L琼脂粉 ,pH 6 .0;黄果 , 1/2MS+

　　0 .5 mg/LNAA+0 .5 mg/LIAA + 15 g/L 白 砂 糖 + 6 .5 g/L琼 脂 粉 , pH 5 .8 ~ 6 .0;杂 交 种 , 1/2MS+

　　0 .9 mg/LNAA+ 0 .1 mg/LIAA+15 g/L 白砂糖 +6 .5 g/L琼脂粉 ,pH 5 .8 ~ 6 .0 。

　　A.2 植物生长调节剂配制

　　植物生长调节剂见表 A.1 。

　　表 A.1 植物生长调节剂

　　附 录 B

　　(资料性)

　　西番莲特定病毒检测方法

　　B.1 提前样品总 RNA

　　取 100 mg~ 10 000 mg新鲜的西番莲嫩叶 ,置于研钵中 ,加液氮研磨 ,将研碎的粉末装入无 RNA 酶的 1 .5 mL离心管中 ,加入裂解液 ,按照植物 RNA提取试剂盒说明书进行操作 ,提取西番莲植物总 RNA。

　　B.2 cDNA合成

　　以 RNA 为模板 ,按照 RT_PCR反转录试剂盒的操作说明书进行逆转录反应合成 cDNA第一链。

　　B.3 聚合酶链式反应(PCR)

　　B.3 .1 反应体系

　　经过 鉴 定 第 一 链 cDNA 成 功 后 , 分 别 以 cDNA/DNA 为 模 板 对 引物 进 行 RT_PCR/PCR 扩 增。 RT_PCR/PCR反应体系(20 μL) :2× HSTMmix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 μmol/L)

　　0 .5 μL,ddH2 O 7 μL,cDNA 2 μL。

　　B.3 .2 PCR扩增条件

　　PCR扩增条件见 B.4 。

　　B.3 .3 PCR产物凝聚电泳

　　称取琼脂糖 0 .3 g,量取 20 mL 1×TAE缓冲液 ;将琼脂糖放入 1×TAE缓冲液中加热溶解 ,取出冷

　　却至 55 ℃左右 ,加入 1 μL~ 2 μL的核酸染料 goldviewⅡ充分混匀 ;倒入已封好的凝胶平台上 ,插上样品

　　梳 。待凝胶凝固后 ,从制胶平台上除去封带 ,拔出梳子 , 加入足够量的 1×TAE(缓冲液没过凝胶表面约

　　量标准物(DL 2 000)加入样品孔中。 电泳 :将已经凝固好的琼脂糖放入电泳槽里 ,取 8 μL~ 10 μL的扩增

　　产物进行点样 , 电泳条件在 100 V~ 120 V 的电压下 , 电泳 10 min即可在紫外光下观察 DNA 条带 ,用紫

　　外分析仪拍照 ,或用凝胶成像系统输出照片 ,并进行有关的数据分析。

　　B.3 .4 凝聚成像

　　电泳结束后 ,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统或紫外分析仪上成像 ,并将电泳结果形成文件存档或系统拍照保存。

　　B.3 .5 结果判定

　　以带有病毒样品的 cDNA作为阳性对照 ,健康样品为阴性对照。

　　各靶标的阳性对照反应出现与预期大小一致的特异条带 、阴性对照和水对照反应未出现反应条带 ,说明相应的 RT_PCR/PCR反应结果可信。

　　待检样品中出现与阳性对照的片段大小相符合的特异性条带 ,可断定该样品已经感染病毒 ;若与阴性对照相符合(即没有出现条带)可断定为健康样品。

　　内标引物条带与各个特异性带同时扩增出 ,且大小与设计大小一致为检出。 只有内标带扩增 ,没有病

　　毒或病菌特异性带 ,则该样品不携带相应病毒或病菌。

　　B.4 引物序列

　　B.4 .1 西番莲黄果花叶病毒(CMV)引物序列

　　上游引物 :CMV_F1 :5 ,_CCTTTGTRGGKAGTGAACGC_3 ,;

　　下游引物 :CMV_R1 :5 ,_CARTTTGTTGTTGGCTTGGA _3 ,;

　　预期片段大小 :329 bp。

　　扩增条件 :95 ℃预变性 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共进行 35 个循环;72 ℃ 10 min。

　　B.4 .2 夜来香花叶病毒(TeMV)引物序列

　　上游引物 :TeMV_F3 :5 ,_TCAAGTAAGGTGGATGATGTT_3 ,;

　　下游引物 :TeMV_R3 :5 ,_CTGCACAGAGCCAACCCCAA_3 ,;

　　预期片段大小 :816 bp。

　　扩增条件 :94 ℃预变性 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共进行 35 个循环;72 ℃ 10 min

　　B.4 .3 西番莲木质化病毒(PWV)引物序列

　　上游引物 :PWV_F2 :5 ,_GCATACCGTGCCAAGCTTCT_3 ,;

　　下游引物 :PWV _R2 :5 ,_AGAAACATGGAGGGACTGTACATG_3 ,;

　　预期片段大小 :500 bp。

　　扩增条件 :95 ℃预变性 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃退火并延伸 30 s,共进行 45 个循环;60 ℃ 10 min。

　　B.4 .4 东亚西番莲病毒(EAPV)引物序列

　　上游引物 :EAPV_F5 :5 ,_CCCATGGTATTCAGCAGTCCAAAG AG_3 ,;

　　下游引物 :EAPV_R5 :5 ,_GGGAATTCATACCCAAAAGGGTGT_3 ,;

　　预期片段大小 :527 bp。

　　扩增条件 :98 ℃预变性 1 min;96 ℃ 25 s,54 ℃ 25 s,72 ℃ 1 min,共进行 30 个循环;72 ℃ 3 min。

　　B.4 .5 广东番木瓜曲叶病毒(PaLCuGDV)引物序列

　　上游引物 :PaLCuGDV_F4 :5 ,_TGTGAAGGNCCDTGTAARGT_3 ,;

　　下游引物 :PaLCuGDV_R4 :5 ,_AGAACTTGAAACCTATCTCTGTTGT_3 ,;

　　预期片段大小 :345 bp。

　　扩增条件 :98 ℃预变性 1 min;96 ℃ 25 s,54 ℃ 25 s,72 ℃ 1 min,共进行 30 个循环;72 ℃ 3 min。

　　B.4 .6 西番莲大戟曲叶病毒(EuLCV)引物序列

　　上游引物 :PaMV_F6 :5 ,_TGTGAAGGNCCDTGTAARGT_3 ,;

　　下游引物 :PaMV_R6 :5 ,_CGGGCCGTCGATCCCTAACAAG_3 ,;

　　预期片段大小 :235 bp。

　　扩增条件 :98 ℃预变性 1 min;96 ℃ 25 s,54 ℃ 25 s,72 ℃ 1 min,共进行 30 个循环;72 ℃ 3 min。

　　B.4 .7 西番莲潜隐病毒(PLV)引物序列

　　上游引物 :PeCarLV_F7 :5 ,_GGGCTKGGKGTRCCHACKGA_3 ,;

　　下游引物 :PeCarLV_R7 :5 ,_TCGAAGSWRTCRAARGCWGC_3 ,;

　　预期片段大小 :299 bp。

　　扩增条件 :94 ℃预变性 3 min;94 ℃ 40 s,52 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,共进行 35 个循环;72 ℃ 10 min。

　　B.4 .8 西番莲内标基因(PeERS2)引物序列

　　上游引物 :ERS2__F:5 ,_GGCGACCCACTTCATAAATC_3 ,;

　　下游引物 :ERS2__R:5 ,_CACGGACAGCAACAACCTCT_3 ,;

　　预期片段大小 :557 bp。

　　扩增条件 :95 ℃预变性 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s, 共进行 35 个循环;72 ℃ 10 min

　　附 录 C

　　(资料性)

　　西番莲(百香果)常见病虫害综合防治

　　西番莲(百香果)常见病虫害综合防治见表 C.1 。

　　表 C.1 西番莲(百香果)常见病虫害综合防治

　　参 考 文 献

　　[1 ] NY/T 2724

　　甘蔗脱毒种苗生产技术规程

　　第 8 部分 :种苗质量要求和检查判断规则