NY/T 4766-2025 小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术规程

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4766—2025

　　小麦田山羊草属杂草抗药性监测

　　技术规程

　　Technical code of practice for herbicide resistance monitoring

　　of Aegilops spp. in wheat field

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部种植业管理司提出并归 口 .

　　本文件起草单位 : 中国农业科学院植物保护研究所 、全国农业技术推广服务中心 .

　　本文件主要起草人 :崔海兰 、张帅 、李香菊 、王云鹏 、于海燕 、陈景超 、何胜龙 、刘芷含 、赵鹤 .

　　小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术规程

　　1 范围

　　本文件规定了小麦田山羊草属杂草(Aegilops spp.) 抗药性监测的基本方法 .

　　本文件适用于小麦田山羊草属杂草对除草剂的抗性监测 .

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件 .

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　NY/T 1155 .3 农药室内生物测定试验准则 除草剂 第 3 部分 :活性测定试验 土壤喷雾法

　　NY/T 1155 .4 农药室内生物测定试验准则 除草剂 第 4 部分 :活性测定试验 茎叶喷雾法NY/T 3543—2020 小麦田看麦娘属杂草抗药性监测技术规程

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 .

　　4 技术流程

　　小麦田山羊草属杂草抗药性监测技术流程见图 1 .

　　抗药性水平的评估 ( 见第9章)

　　图 1 技术流程

　　5 试剂与材料

　　5 .1 监测对象

　　节节麦(AegilopstauschiiCoss.) 、圆柱山羊草(Aegilopscylindrica Host)等山羊草属杂草 .

　　5 .2 试验药剂

　　待测除草剂原药或制剂 .

　　5 .3 其他试剂

　　除非另有说明 ,所用试剂均为分析纯 . 实验室用水符合 GB/T 6682 规定的二级水要求 .

　　6 主要仪器和设备

　　6 .1 分析天平 :感量为 0 .001 g.

　　6 .2 喷雾设备 :压力稳定 ,带扇形喷头的可定量喷雾装置 .

　　6 .3 温度和光照可控温室 :温度范围为 15 ℃ ~ 25 ℃ ,光照强度不小于 30 000 lx.

　　6 .4 PCR扩增仪 :升降温速度 >1 .5 ℃/s,孔间温度差异<1 .0 ℃ .

　　6 .5 电泳槽 、电泳仪等电泳装置 .

　　6 .6 凝胶成像系统 .

　　7 试验步骤

　　7 .1 杂草种子采集与保存

　　在山羊草属杂草发生危害的麦田设立采样点 ,根据杂草在田间的分布情况 ,采用倒置 “W”九点取样 、五点取样或“Z”字取样等方法 ,采集成熟的山羊草属杂草种子 ,每个点采集杂草株数不少于 30 株 ,将几个点采集的种子混合 ,作为一 个 种 群 , 记 录 采 集 信 息(见 附 录 A) . 将 采 集 的 种 子 晾 干 , 并 置 于 阴 凉 干 燥 处保存 .

　　7 .2 试材培养

　　选择无山羊草属杂草种子 、无除草剂残留的农田地表土 ,混合 20% ~ 30%的草炭土 ,混合均匀后装入直径不小于 10 cm 的培养钵 ;将待测种群及敏感对照的种子 ,用清水浸泡 24 h后 ,每个培养钵定量均匀撒播在土壤表面 ,覆土 1 .5 cm~ 2 .0 cm ,待测除草剂为土壤处理剂时需要严格定量播种 . 采用盆钵底部渗灌方式补充水分 ,使每个营养钵内土壤相对湿度保持一致 ; 置于 25 ℃ (昼)/15 ℃ (夜) ,光照时间 12 h 条件下培养 .

　　7 .3 药剂处理

　　7 .3 .1 茎叶处理法

　　待植株长至 2 叶期间苗 ,保留长势一致的植株 ,每个培养钵保留植株数量相同 ,一般不少于 15 株 ,待供试杂草长至 3 叶 1 心期茎叶喷雾施药 . 以待测药剂的田间推荐剂量为基准 ,在预实验的基础上 ,设计至少 5 个系列剂量梯度的除草剂处理 ,并以不含除草剂(含有溶剂 、乳化剂)的处理作为空白对照 . 每个剂量不少于 3 次重复 . 处理后按照 7 .2 培养条件继续培养 . 在施药后 14 d~ 21 d,调查每个处理的存活植株数 、地上部分鲜重或干重 .

　　7 .3 .2 土壤处理法

　　在播种后出苗前进行土壤喷雾处理 . 以待测药剂的田间推荐剂量为基准 ,在预实验的基础上 ,设计至少 5 个系列剂量梯度的除草剂处理 ,并以不含除草剂(含有溶剂 、乳化剂)的处理作为空白对照 . 每个剂量不少于 3 次重复 . 处理后按照 7 .2 培养条件继续培养 . 在施药后 21 d~ 28 d,调查每个处理的存活植株数 、地上部分鲜重或干重 .

　　7 .4 靶标基因检测

　　7 .4 .1 DNA提取

　　确认有 抗 药 性 的 植 株 , 取 叶 片 提 取 总 DNA. 每 个 种 群 随 机 检 测 抗 药 性 植 株 不 少 于 10 株 , 并 单 株检测 .

　　7 .4 .2 聚合酶链式反应(PCR)

　　根据靶标基因编码区序列设计引物 ,通过 PCR反应扩增靶标基因序列 .

　　7 .4 .3 PCR产物测序

　　PCR产物采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒进行回收纯化 ,纯化后的 PCR产物测序。

　　8 数据统计与分析

　　8 .1 存活率计算

　　按公式(1)计算杂草存活率。

　　E × 100 … … … … … … … … … … … … … … … … … (1)

　　式中 :

　　E — 存活率的数值 ,单位为百分号(%) ;

　　Nx — 除草剂剂量 X g a.i. /hm2 处理后存活植株数的数值 ,单位为株 ;

　　N0 — 除草剂剂量 X g a.i. /hm2 处理前总株数的数值 ,单位为株。

　　8 .2 生长抑制中量计算

　　按公式(2)计算杂草鲜重或干重抑制率。

　　Y=M00Mx × 100 … … … … … … … … … … … … … … … … (2)

　　式中 :

　　Y — 鲜重或干重抑制率的数值 ,单位为百分号(%) ;

　　M0 — 对照地上部分鲜重或干重的数值 ,单位为克(g) ;

　　Mx — 除草剂剂量 X g a.i. /hm2 处理后地上部分鲜重或干重的数值 ,单位为克(g)。

　　用杂草鲜重或干重抑制率与 对 应 的 处 理 剂 量 按 公 式 (3)或 公 式 (4)拟 合 回 归 方 程 , 并 计 算 生 长 抑 制中量。

　　式中 : Y′=a+bX … … … … … … … … … … … … … … … … … … (3)

　　Y′— 鲜重或干重抑制率概率值 ;

　　a— 截距 ;

　　b — 斜率 ;

　　X′— 除草剂有效剂量的对数值。

　　式中 :

　　C —Y 值下限的数值 ,单位为百分率(%) ;

　　D —Y 值上限的数值 ,单位为百分率(%) ;

　　X — 除草剂有效剂量的数值 ,单位为克有效成分每公顷(g a.i. /hm2 ) ; GR50 — 生长抑制中量的数值 ,单位为克有效成分每公顷(g a.i. /hm2 )。

　　8 .3 抗药性水平计算

　　按公式(5)计算抗药性指数。

　　RI … … … … … … … … … … … … … … … … … … (4)

　　式中 :

　　RI — 抗药性指数 ;

　　GR50R — 测试种群的 GR50 ;

　　GR50S— 敏感种群的 GR50 。

　　8 .4 靶标基因序列比对分析

　　测序结果与敏感对照序列进行比对 ,并以已报道的突变位点为参考 ,分析靶标序列突变位点。

　　9 抗药性水平的评估

　　9 .1 抗药性水平分级

　　通过公式(1)计算在敏感对照全部死亡的剂量及更高剂量下存活率 ,可以初步判断种群中抗药性植株所占比例 ;根据公式(5)计算的 RI值评估该种群的抗药性水平 ,根据表 1 中抗药性水平分级标准分为低 、中 、高水平抗药性。

　　表 1 杂草抗药性水平的分级标准

　　9 .2 靶标抗性判断

　　通过生物测定确认有抗药性 ,且通过靶标基因检测在对应已报道的抗药性位点发生突变时 , 即判断为

　　靶标抗性 ,在保守区发现新的突变位点时 ,需进一步检测确认。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　杂草种子采集信息登记表

　　杂草种子采集信息登记表见表 A.1 。

　　表 A.1 杂草种子采集信息登记表样品编号 :

　　采样人 : 采集单位 : 采样 日期 : 年 月 日

　　附 录 B

　　(资料性)

　　节节麦和圆柱山羊草乙酰乳酸合成酶(ALS)基因克隆和分析方法

　　B.1 节节麦 ALS克隆

　　下列 3 对引 物 可 扩 增 节 节 麦 ALS 基 因 序 列 片 段 , 第 一 对 引 物 的 正 向 引 物 为 : 5 ,_GGGCGCCGA_

　　CATCCTCGTC_3 ,,反向引物为 :5 ,_CAGCCACCACCAACATACAG_3 ,,扩增片段大小为 636 bp;第二对

　　引物 的 正 向 引 物 为 5 ,_CCAAGGACATCCAACAGCA_3 ,, 反 向 引 物 为 : 5 ,_CGCCAACTCCTGAATGT_

　　TC_3 ,,扩增片段大小为 883 bp;第三对引物的正向引物为 5 ,_GCACATTGACATTGACCCAG_3 ,,反向引

　　物为 : 5 ,_TCTTATGACAGCACATCCCTA_3 ,, 扩 增 片 段 大 小 为 1 039 bp。 也 可 参 照 小 麦 D 染 色 体 组

　　ALS基因(TraesCS6D01G268700)设计引物扩增靶标基因序列。

　　PCR反应体系参考如下 :10 μmol/L的引物各 1 .0 μL,5 U/μL的 Taq DNA 聚合酶 0 .25 μL,提取的待测 DNA样品 1 μL~ 2 μL,按照产品说明分别加入 dNTP混合液和缓冲液 ,加入无菌蒸馏水至反应体系为 25 μL。PCR反应条件参考如下 : 94 ℃加热 10 min,使 DNA 裂解变性 ;进入反应循环 ,在每一个循环中 ,94 ℃裂 解 30 s, 引 物 退 火 温 度 下 退 火 30 s, 72 ℃延 伸 1 .0 min, 共 35 个 循 环 ; 最 后 72 ℃继 续 延 伸10 min,使产物延伸完整。 上述 3 对引物的退火温度分别为 62 ℃ 、55 .5 ℃和 56 ℃ 。

　　B.2 圆柱山羊草 ALS克隆

　　用下列引物扩增圆柱 山 羊 草 ALS基 因 序 列 , 正 向 引 物 为 : 5 ,_ATGGCCGCCGCCACCTCC _3 ,, 反 向引物为 :5 ,_TCAGTACGAGGTCCTGCCATCA_3 ,,扩增片段大小为 1 935 bp, 引物的退火温度为 62 ℃ 。

　　也可参照小麦 D染色体组 ALS基因(TraesCS6D01G268700)设计引物扩增靶标基因序列。

　　PCR反应体系和反应条件可以参考节节麦 ALS扩增反应。

　　B.3 靶标基因检测结果分析

　　测序结果首先用软件查看测序峰图 ,根据测序峰图是否正常 、有无杂峰等来判断测序结果是否可用。测序的碱基序列翻译成 氨 基 酸 序 列 , 并 与 拟 南 芥 (Arabidopsisthaliana) (GenBank 上 的 登 记 号 为 NM_ 114714 .3)的 ALS氨基酸序列进行比对 ,分析氨基酸发生取代的位点。

　　目前 ,在抗 ALS抑制剂类除草剂的杂草中 ,发现有 9 个位点氨基酸被取代与抗药性有关 ,分别是 122位丙氨酸 、197 位脯氨酸 、205 位丙氨酸 、206 位苯丙氨酸 、376 位天冬氨酸 、377 位精氨酸 、574 位色氨酸 、 653 位丝氨酸和 654 位甘氨酸(氨基酸序列以拟南芥为参照)。