NY/T 4935-2025 番茄品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4935—2025

　　番茄品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　Tomato (Solanum lycopersicum L.) variety genuineness

　　identification—SSR based method

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容有可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部种业管理司提出 .

　　本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC 37)归 口 .

　　本文件起草单位 :北京市农林科学院蔬菜研究所 、全国农业技术推广服务中心 、中国农业科学院蔬菜花卉研究所 、石家庄博瑞迪生物技术有限公司 、京研益农(北京)种业科技有限公司 、北京蔬菜学会 .

　　本文件主要起草人 :温常龙 、晋芳 、张建 、景琦 、李常保 、张嘉楠 、王红阳 、杨静静 、杨坤 、张海军 、张晓飞 、邱艳红 、周明 、任君 、俞新华 .

　　番茄品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　1 范围

　　本文件规定了利用 SSR分子标记法进行番茄(Solanum lycopersicum L.) 品种真实性鉴定的原理和总则 、鉴定程序 、结果表示等。

　　本文件适用于番茄 常 规 种 和 杂 交 种 的 品 种 真 实 性 身 份 验 证 、真 实 性 身 份 鉴 定 , 也 适 用 于 品 种 关 系鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件。

　　GB/T 3543 .1 农作物种子检验规程 第 1 部分 :总则

　　GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程 第 2 部分 :扦样

　　GB/T 3543 .11 农作物种子检验规程 第 11 部分 : 品种质量 品种真实性鉴定

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 .1

　　品种真实性身份验证 variety verification

　　经与其对应品种名称的标准样品比较 ,鉴定供检样品标注的品种名称是否真实。

　　3 .2

　　品种真实性身份鉴定 varietyidentification

　　经与标准品种指纹数据比对平台筛查比较 ,鉴定供检样品的品种真实名称或与其他品种的同一性。 3 .3

　　标准样品 standard sample

　　国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。

　　3 .4

　　参照样品 referencecontrolsample

　　用于校准待测样品等位变异且已定义基因型的样品。

　　3 .5

　　引物组合 primerpanel

　　具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同 、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记引物。

　　3 .6

　　SSR指纹数据比对平台 SSR fingerprintblastplatform

　　采用 SSR分子标记的规定位点组合鉴定品种标准样品等位变异的信息 ,运用数据库和网络信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　bp:碱基对(base pair)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy_ribonucleoside triphosphate)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)

　　PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)

　　Taq酶 :耐热 DNA聚合酶(Taq_DNA polymerase)

　　TBE:三羟甲基氨基甲烷__硼酸盐__乙二胺四乙酸(Tris_Borate_EDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) aminomethane]

　　5 原理和总则

　　5 .1 原理

　　番茄不同品种基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)差异 ,这种差异可通过从有代表性的混合试样或个体试样中提取 DNA,采用 SSR 位点组合进行扩增 ,检测其扩增产物加以区分 ,通过分析样品间 DNA位点差异鉴定品种真实性。

　　注 :DNA提取 、PCR扩增 、电泳 、银染的溶液参照附录 A配制 ,所用试剂均为分析纯。

　　5 .2 总则

　　5 .2 .1 样品状况 、引物 、检测平台不同 ,其检测结果准确度 、精确度可能有所不同。 应依据 “适于检测 目

　　的 ”的原则 ,统筹考虑检测规模和检测能力 ,选定适宜的样品数量 、引物 、检测平台 ,制订相应的检测方案。

　　5 .2 .2 首先选择附录 B 中前 14 对引物进行检测 , 当样品间检测出的差异位点数小于 3 时 ,再选用附录 B中后 14 对引物进行检测 ;必要时 ,进一步选择特定标记进行检测。

　　5 .2 .3 本文件推荐了变性 PAGE垂直板电泳和毛细管电泳 2 个检测平台。 对于品种真实性身份验证 ,

　　6 试验条件

　　真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行 ,包括但不限于下列条件 :

　　a) 检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能 ;

　　b) 所用仪器与使用的技术相适应 ,并已经过定期维护 、验证和校准 ;

　　c) 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材 ;

　　d) 使用经校准检测评定的参照样品。

　　7 试剂

　　7 .1 DNA提取

　　7 .1 .1 液氮(N2) 。

　　7 .1 .2 SDS(C12 H25 NaSO4 ,CAS号 :151__21__3) 。

　　7 .1 .3 氯化钠(NaCl,CAS号 :7647__14__5) 。

　　7 .1 .4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2 . 2H2 O,C10 H14 N2 Na2 O8 ,CAS号 :6381__92__6) 。

　　7 .1 .5 三羟甲基氨基甲烷[Tris,NH2 C(CH2 OH) 3 ,CAS号 :77__86__1]。

　　7 .1 .6 无水乙醇(CH3 CH2 OH ,CAS号 :64__17__5) 。

　　7 .1 .7 盐酸(HCl,CAS号 :7647__01__0) 。

　　7 .1 .8 氢氧化钠(NaOH ,CAS号 :1310__73__2) 。

　　2

　　7 .1 .9 异丙醇(C3 H8 O,CAS号 :67__63__0) 。

　　7 .1 .10 醋酸钾(C2 H3 KO2 ,CAS号 :127__08__2) 。

　　7 .2 PCR扩增

　　7 .2 .1 dNTPs。

　　7 .2 .2 10×PCR Buffer (含 MgCl2) 。

　　7 .2 .3 Taq酶 。

　　7 .2 .4 2×Taq Mix。

　　7 .3 电泳

　　7 .3 .1 变性 PAGE垂直板

　　7 .3 .1 .1 丙烯酰胺(C3 H5 NO,CAS号 :79__06__1) 。

　　7 .3 .1 .2 N ,N_亚甲基双丙烯酰胺(C7 H10 N2 O2 ,CAS号 :110__26__9) 。

　　7 .3 .1 .3 尿素(CH4 N2 O,CAS号 :57__13__6) 。

　　7 .3 .1 .4 去离子甲酰胺(CH3 NO,CAS号 :75__12__7) 。

　　7 .3 .1 .5 乙二胺四乙酸(EDTA,C10 H14 N2 O8 ,CAS号 :60__00__4) 。

　　7 .3 .1 .6 溴酚蓝(C19 H10 Br4 O5 S,CAS号 :115__39__9) 。

　　7 .3 .1 .7 二甲苯青(C25 H27 N2 NaO7 S2 ,CAS号 :4463__44__9) 。

　　7 .3 .1 .8 三羟甲基氨基甲烷(C4 H11 NO3 ,CAS号 :77__86__1) 。

　　7 .3 .1 .9 硼酸(BH3 O,CAS号 :10043__35__3) 。

　　7 .3 .1 .10 无水乙醇(C2 H6 O,CAS号 :64__17__5) 。

　　7 .3 .1 .1 1 亲和硅烷(binding silane) 。

　　7 .3 .1 .12 剥离硅烷(repel silane) 。

　　7 .3 .1 .13 过硫酸铵(APS, H8 N2 O8 S2 ,CAS号 :7727__54__0) 。

　　7 .3 .1 .14 冰醋酸(Acetic acid) (C2 H4 O2 ,CAS号 :64__19__7) 。

　　7 .3 .1 .15 四甲基乙二胺(TEMED,C6 H16 N2 ,CAS号 :110__18__9) 。

　　7 .3 .1 .16 硝酸银(AgNO3 ,CAS号 :7761__88__8) 。

　　7 .3 .1 .17 氢氧化钠(NaOH ,CAS号 :1310__73__2) 。

　　7 .3 .1 .18 乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2 . 2H2 O,C10 H14 N2 Na2 O8 ,CAS号 :6381__92__6) 。

　　7 .3 .1 .19 甲醛(CH2 O,CAS号 :50__00__0) 。

　　7 .3 .1 .20 DNA分子量标准。

　　7 .3 .2 毛细管电泳

　　与使用的毛细管电泳仪型号相匹配的分离胶 、分子量内标 、去离子甲酰胺 、电泳缓冲液等。

　　8 仪器设备

　　8 .1 高速冷冻离心机 :转速 ≥12 000 r/min。

　　8 .2 微量移液器或微量移液工作站。

　　8 .3 水浴锅或干式恒温金属浴 :20 ℃ ~ 65 ℃ 。

　　8 .4 紫外分光光度计 :波长定点扫描 230 nm、260 nm 和 280 nm。

　　8 .5 组织研磨仪。

　　8 .6 分析天平 :感量为 0 .01 g。

　　8 .7 pH 计 。

　　8 .8 涡旋混合器。

　　8 .9 高压灭菌锅。

　　8 .10 PCR扩增仪。

　　8 .1 1 高压电泳仪。

　　8 .12 垂直板电泳槽及其配套的制胶附件。

　　8 .13 胶片观察灯。

　　8 .14 水平摇床。

　　8 .15 凝胶成像系统或数码相机。

　　8 .16 毛细管电泳仪。

　　9 样品

　　9 .1 送验样品可为种子 、幼苗 、叶片等组织或器官 ,需要扦样的种子样品数量应符合 GB/T 3543 .2 的规

　　定 。送验样品如为种子 ,质量应不低于 3 g或数量不少于 500 粒 ;送验样品如为幼苗 、叶片 、果实等组织或

　　器官 ,应至少来自 30 个随机个体。

　　9 .2 试验样品采用混样检测 ,样品不少于 30 个个体。

　　10 检测程序

　　10 .1 引物合成

　　电泳 ,只需合成普通引物。 选用荧光毛细管电泳 ,在上游 SSR 引物的 5 9端标记与毛细管电泳仪发射和吸

　　10 .2 DNA提取

　　10 .2 .1 DNA质量要求

　　DNA提取方法应保证提取的 DNA质量符合 PCR 扩增的要求 ,DNA 无降解 ,溶液的紫外光吸光度

　　OD260 /OD280 宜介于 1 .7 ~ 2 .0 ,OD260 /OD230 宜介于 1 .5 ~ 2 .0 。 以下为推荐的 DNA提取方法 ,其他能够达

　　到要求的 DNA提取方法均适用于本文件。

　　10 .2 .2 SDS法

　　取试样的种子 、胚根或叶片 300 mg~ 400 mg,加入液氮迅速研磨成粉 末 后 , 转 入 2 .0 mL 的 离 心 管

　　中 。在离心管中加入 65 ℃预热的 SDS提取液 800 μL,充分混匀 ,65 ℃水浴 30 min,其间多次轻缓颠倒混

　　。3i, Ar入in μi。, 醇。溶液洗涤 2 遍 , 自然干燥或在超

　　10 .2 .3 试剂盒法

　　选用适宜 SSR标记法的商业试剂盒 ,并经验证合格后使用。 DNA提取方法 ,按照试剂盒提供的使用

　　说明进行操作。

　　10 .3 PCR扩增

　　10 .3 .1 反应体系

　　PCR扩增反应体系的总体积和组分终浓度根据表 1 进行配制。 可依据试验条件的不同作适当调整。

　　表 1 PCR扩增反应体系

　　表 1 (续)

　　10 .3 .2 反应程序

　　反应程序中各反应参数可根据 PCR扩增仪型号 、酶 、引物等的不同作适当调整 . 通常采用下列反应程序 :

　　a) 预变性 :95 ℃ ,5 min,1 个循环 ;

　　b) 扩增 :95 ℃变性 30 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,35 个循环 ;

　　c) 终延伸 :72 ℃ ,10 min;

　　d) 扩增产物置于 4 ℃保存 .

　　10 .4 扩增产物分离

　　10 .4 .1 变性 PAGE垂直板电泳

　　10 .4 .1 .1 制胶

　　蘸少量洗涤剂和清水仔细反复将玻璃板刷洗 ,再用蒸馏水冲洗干净 ,竖置晾干 . 将玻璃板水平放置 ,用 95%乙醇纵向横向各擦拭板面 3 次 . 干燥后使用亲和硅烷工作液均匀涂满无凹槽的玻璃板表面 ,剥离硅烷工作液均匀涂在有凹槽的玻璃板表面 .

　　玻璃板干燥后 ,将 0 .4 mm 厚的塑料隔条放在无凹槽的玻璃板两侧 ,盖上凹槽短玻璃板 ,用夹子在两侧夹好固定 ,用水平仪检测是否水平 . 量取 80 mL 6%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液 ,加入 180 μL 10%过硫酸铵和 60 μLTEMED,轻轻混匀后 ,沿着灌胶口轻轻灌入 , 防止气泡出现 . 胶灌满玻璃胶室 ,在凹槽处将鲨鱼齿梳子的平端插入胶液 5 mm~ 6 mm. 室温下胶聚合 0 .5 h~ 1 .0 h 后 ,轻轻拔出梳子 ,用清水洗干净备用 .

　　注 :为保证检测结果的准确性 ,建议玻璃板的规格宜为 45 cm×35 cm.

　　10 .4 .1 .2 变性

　　将 4 μL上样缓冲液(A.3 .1)加入 PCR扩增产物 ,离心混匀 . 95 ℃变性 5 min后 ,取出迅速放置于冰上 ,冷却 10 min待用 .

　　10 .4 .1 .3 电泳

　　10 .4 .1 .3 .1 将聚合好的胶板安装于电泳槽上 ,在电泳正极槽(下槽)加入 600 mL 的 1×TBE缓冲液 ,负极槽(上槽)加入 600 mL 的 1×TBE缓冲液 ,拔出样品梳 ,在 180 V 恒压预电泳 20 min~ 30 min,用注射器或吸管清除加样槽孔内的气泡和杂质 ,将样品梳插入胶中 1 mm~ 2 mm. 每一个加样孔加入 5 μL~ 8 μL变性样品 ,在 180 V恒压下电泳 .

　　10 .4 .1 .3 .2 电泳的适宜时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(见附录 C)加以确定 . 扩增产物片段大小在(100±30)bp、(150±30)bp、(200±30)bp、(250±30)bp范围的 , 电泳参考时间分别为 0 .6 h、0 .9 h、1 .2 h、1 .5 h. 电泳结束后关闭电源 ,取下玻璃板并轻轻撬开 ,凝胶附着在无凹槽的玻璃板上 .

　　10 .4 .1 .4 银染

　　将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入 “固定/染色液 ”中 , 轻摇染色槽 ,使 “固定/染色液 ”均匀覆盖胶板 ,置于摇床上染色 5 min~ 10 min. 将胶板移入水中漂洗 30 s~ 60 s. 再移入显影液中 ,轻摇显影槽 ,使显影液均匀覆盖胶板 ,待带型清晰 ,将胶板移入去离子水中漂洗 5 min, 晾干胶板 ,放在胶片观察灯上观察记录结果 ,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存 .

　　注 : 固定液 、染色液 、双蒸水和显影液的用量 ,可依据胶板数量和大小调整 , 以没过胶面为准 .

　　10 .4 .2 荧光毛细管电泳

　　10 .4 .2 .1 按照预先确定的 组 合 引 物 , 等 体 积 取 同 一 组 合 引 物 的 不 同 荧 光 标 记 的 扩 增 产 物 , 充 分 混 匀 ,稀释约 200 倍 . 吸取稀释后的混合液 1 .5 μL,加入毛细管电泳仪专用 96 孔上样板上 . 每孔再分别加入0 .1 μL分子量内标和 8 .9 μL去离子甲酰胺 ,95 ℃变性 5 min,取出立即置于冰上 ,冷却 10 min以上 ,离心10 s后备用 .

　　注 :本方法是以 ABI3730 荧光毛细管检测平台为参考 ,如使用其他平台应根据设备作相应调整 .

　　10 .4 .2 .2 打开毛细管电泳仪 ,检查仪器工作状态和试剂状态 .

　　10 .4 .2 .3 将装有扩增产物的 96 孔上样板放置于样品架基座上 ,将装有电极缓冲液的 buffer板放置于buffer板架基座上 ,打开数据收集软件 ,按照毛细管电泳仪的使用手册进行操作 . 毛细管电泳仪将自动运行参数 ,并保存电泳原始数据 .

　　10 .5 数据分析

　　10 .5 .1 总则

　　10 .5 .1 .1 电泳结果需要通过规定程序进行数据分析以降低误读率 . 在引物等位变异片段大小范围内(见附录 C) ,对于毛细管电泳 ,特异峰呈现为稳定的单峰型 、双峰型或连续峰型 ;对于变性 PAGE垂直板电泳 ,特异谱带呈现稳定的单谱带 、双谱带或连续谱带 .

　　10 .5 .1 .2 对于毛细管电泳 , 由于不同引物扩增产物表现不同 、引物不对称扩增 、试验条件干扰等因素影响 ,可能出现不同状况的峰型 ,按照以峰高为主 、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别 、过滤处置 :

　　a) 对于连带(pull-up)峰 , 即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光

　　b) 对于(n+1)峰 , 即对于同一位置出现 2 个相距 1 bp左右的峰 ,应视为单峰 ;

　　c) 对于高低峰 ,应通过设定一定阈值不予采集低于阈值的峰 ;

　　d) 对于有 2 个以上特异峰 ,应考虑是由非纯合 SSR位点或混入杂株所致 ;

　　e) 对于连续多峰 , 即峰高递增或峰高接近的相差一个重复序列的连续多个峰 ,应视为单峰 ,取其最右边的峰 ,峰高值为连续多个峰的叠加值 .

　　注 : 当存在非纯合 SSR位点时 ,将会有 2 个特异峰 ,此时应采集 2 个峰值 .

　　10 .5 .1 .3 对于变性 PAGE垂直板电泳 ,位于相应等位变异扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特异性扩增还是新增的稀有等位变异 . 采用单个个体扩增的产物 , 出现 3 种及 3 种以上的多带则为非特异性扩增 ;采用混合样检测的 ,某些位点出现 3 种以上的谱带或上下有弱带等情况出现时 ,则需要通过单个个体进行甄别 .

　　10 .5 .1 .4 采取混合样检测的 ,无论是毛细管电泳还是变性 PAGE垂直板电泳 ,送验样品存在异质性时 ,宜采用单个个体独立检测 ,试样至少含有 30 个个体 . 异质性严重时 ,可终止真实性检测 .

　　10 .5 .2 数据分析和读取

　　10 .5 .2 .1 变性 PAGE垂直板电泳

　　对甄别后的特异谱带进行扩增片段大小的读取 ,统一采用两段式数据记录方式(见附录 D) . 纯合位点数据记录为 X/X ,非纯合 位 点 数 据 记 录 为 X/Y(其 中 X、Y 分 别 为 该 位 点 2 个 等 位 基 因 扩 增 片 段 大小) ,小片段数据在前 ,大片段数据在后 . 缺失位点数据记录为 0/0 .

　　10 .5 .2 .2 毛细管电泳

　　导出电泳原始数据文件 ,采用数据分析软件对数据进行甄别 ,按照下列步骤执行 :

　　a) 设置参数 :在数据分析软件中预先设置好 panel、分子量内标 、panel的相应引物的 Bin(等位变异片段大小范围区间) ;

　　b) 导入原始数据文件 :将电泳原始数据文件导入分析软件 ,选择 panel、分子量内标 、Bin、质量控制参数等进行分析 ;

　　c) 甄别过滤处置数据 :执行 10 .5 .1 的规定 .

　　分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分 ,绿色表示质量可靠无需干预 ,红色表示质量不过关或未落入 Bin范围内 ,黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认。

　　数据比对采用 10 .5 .3 .1 、10 .5 .3 .2 方式的 ,应分别通过同时进行试验的标准样品 、参照样品(依据引物选择少量的对照) ,校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小。 甄别后的特异峰落入 Bin范围内 ,直接读取扩增片段大小 ;若其峰大多不在 Bin范围内 , 可将其整体平移尽量使峰落入 Bin设置范围内后读取数据。

　　10 .5 .3 数据比对

　　10 .5 .3 .1 采用与标准样品比较的 ,对甄别后的特异谱带或特异峰(见 10 .5 .1) ,按照在同一电泳板上的送验样品与标准样品逐个位点进行两两比较 ,确定其位点差异。

　　10 .5 .3 .2 采用毛细管电泳与 SSR指纹数据库比对的 ,按照数据导入模板的要求 ,将数据及其指纹截图上传到 SSR指纹数据库 ,进行逐个位点在线比对 ,核实确定相互间的指纹数据的异同。

　　10 .5 .3 .3 采用 PAGE垂直板电泳与 SSR指纹数据库比对的 ,按照数据导入模板的要求 ,将数据上传到SSR指纹数据库 ,进行逐个位点的两两比对 ,核实确定相互间的指纹数据的异同。

　　注 :采用 PAGE垂直板电泳与 SSR指纹数据库比对较为困难 ,仅作为参考使用 , 比对前应采取以下措施 :

　　a) 读取扩增产物片段大小数据的 ,送验样品与参照样品同时在同一电泳板上电泳 ;

　　b) 电泳时间足够 ;

　　c) 送验样品存在扩增片段为一个基序差异的 ,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取。

　　10 .5 .4 数据记录

　　数据比对后 ,按照位点存在差异 、相同 、数据缺失 、无法判定等情形 ,记录每个引物的位点状况。

　　1 1 鉴定意见

　　1 1 .1 品种真实性身份验证

　　鉴定意见可参考以下原则 :

　　a) 送验样品与标准样品比较 ,差异位点数 ≥3 ,排除两者为同一品种 ;

　　b) 送验样品与标准样品比较 ,差异位点数为 1 或 2 ,不确定两者为同一品种 ;

　　c) 送验样品与标准样品比较 ,差异位点数为 0 ,不排除两者属于同一品种。

　　1 1 .2 品种真实性身份鉴定

　　鉴定意见可参考以下原则 :

　　a) 送验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为 0 ,不排除两者属于同一品种 ;

　　b) 送验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为 1 或 2 ,不确定两者为同一品种 ;

　　c) 送验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数 ≥3 ,排除两者为同 一品种。

　　12 结果报告

　　按照 GB/T 3543 .1 和 GB/T 3543 .11 的规定执行。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　溶 液 配 制

　　A.1 DNA提取

　　A.1 .1 1 mol/L TrisG HCl溶液

　　称取 Tris121 .1 g溶于 800 mL水中 ,加入 HCl调节 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL,121 ℃高温高压灭菌 20 min。

　　A.1 .2 0 .5 mol/L EDTA 溶液

　　称取 EDTA_Na2 . 2H2 O 186 .1 g溶于 800 mL水中 ,加入固体 NaOH 调节 pH 至 8 .0 ,加水定容至1 000 mL,121 ℃高温高压灭菌 20 min。

　　A.1 .3 5 mol/L NaCl溶液

　　称取固体 NaCl146 .1 g溶于适量水中 ,充分搅拌溶解后 ,加水定容至 500 mL, 121 ℃高温高压灭菌20 min。

　　A.1 .4 SDS提取液

　　1 mol/LTris_HCl50 mL、0.5 mol/LEDTA 50 mL、5 mol/L NaCl50 mL、SDS7.5 g,定容至 500 mL。

　　A.1 .5 3 mol/L醋酸钾溶液

　　称取固体醋酸钾 147 .2 g溶于适量水中 ,充分搅拌溶解后 ,加水定容至 500 mL。

　　A.2 PCR扩增

　　A.2 .1 dNTP

　　用超纯水分别配置 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 终浓度为 100 mmol/L 的储存液 ,分别用 0 .05 ml/L的 Tris碱调整 pH 至 7 .0 。各取 80 μL混合 ,用超纯水 480 μL定容至终浓度为 10 mmol/L的工作液。

　　A.2 .2 SSR 引物

　　用超纯水分别配制上游引物 、下游引物终浓度均为 100 μmol/L的储存液。 从 100 μmol/L的储存液

　　中分别吸取上 、下游引物各 10 μL,再分别加入 90 μL超纯水配制成 10 μmol/L的工作液 , - 20 ℃储存。

　　A.3 电泳

　　A.3 .1 6×上样缓冲液

　　去离子甲酰胺 98 mL、0 .5 mol/L EDTA_Na2 . 2H2 O 溶液 2 mL、溴酚蓝 0 .25 g 和二甲苯青 0 .25 g混合摇匀 ,4 ℃备用。

　　A.3 .2 0 .5 mol/L EDTA 溶液

　　称取二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA_Na2 . 2H2 O)18 .61 g溶于水中 ,NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 100 mL,高温高压灭菌后 ,室温保存。

　　A.3 .3 10 × TBE 缓冲液

　　称取三羟甲 基 氨 基 甲 烷 碱 108 g、硼 酸 55 g 溶 于 水 中 , 加 入 0 .5 mol/L EDTA_Na2 . 2H2 O 溶 液40 mL,加水定容至 1 000 mL,于常温避光干燥处保存备用。

　　A.3 .4 1 × TBE 缓冲液

　　量取 100 mL 的 10×TBE缓冲液 ,加水定容至 1 000 mL,于常温避光干燥处保存备用。

　　A.3 .5 6%变性 PAGE胶

　　称取尿素 420 g、丙烯酰胺 57 g、甲叉丙烯酰胺 3 g溶于水中 ,加入 10×TBE缓冲液 50 mL,加水定容

　　至 1 000 mL,用普通滤纸过滤 2 次 ,于常温避光干燥处保存备用 .

　　A.3 .6 亲和硅烷工作液

　　量取 93 mL 的 75%乙醇 、5 mL 的 冰 醋 酸 和 2 mL 的 亲 和 硅 烷 原 液 , 混 匀 , 于 常 温 避 光 干 燥 处 保 存备用 .

　　A.3 .7 剥离硅烷工作液

　　量取 25 mL 的二甲基二氯硅烷 、75 mL 的三氯甲烷混匀 ,于常温避光干燥处保存备用 .

　　A.3 .8 10%过硫酸铵溶液

　　称取过硫酸铵 0 .1 g溶于 1 mL水中 ,4 ℃储存备用 .

　　A.4 银染

　　A.4 .1 固定液

　　量取 200 mL无水乙醇 、10 mL冰醋酸 ,加蒸馏水定容至 2 000 mL.

　　A.4 .2 染色液

　　称取硝酸银 1 g,加水定容至 500 mL.

　　A.4 .3 显色液

　　称取氢氧化钠 15 g溶于 1 000 mL水中 ,使用前加入 5 mL 甲醛溶液 .

　　附 录 B

　　(规范性)

　　SSR 引物序列及标记的荧光信息

　　SSR 引物序列及标记的荧光信息见表 B.1 .

　　表 B.1 SSR 引物序列及标记的荧光信息

　　附 录 C

　　(规范性)

　　引物分组及主要等位变异扩增片段信息

　　引物分组及主要等位变异扩增片段信息见表 C.1 .

　　表 C.1 引物分组及主要等位变异扩增片段信息

　　附 录 D

　　(规范性)

　　参照样品及其等位变异信息

　　参照样品及其等位变异信息见表 D.1 .

　　表 D.1 参照样品及其等位变异信息