NY/T 4937-2025 花椰菜品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4937—2025

　　花椰菜品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　(Brassica oleracea) L.var.(botrytis) L. variety genuineness identification—

　　SSR-based methods

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部种业管理司提出 .

　　本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC 37) 归 口 .

　　本文件起草单位 :深圳市农业科技促进中心 、北京市农林科学院蔬菜研究所 、全国农业技术推广服务中心 、深圳市作物分子设计育种研究院 、上海市农业科学院 .

　　本文件主要起草人 :刘晋 、李筠 、陈子晟 、王学林 、刘斌 、温常龙 、金石桥 、晋芳 、张建 、褚云霞 、章毅颖 、孙全 、刘倩琪 、蒋晓旋 、陈海荣 、卢启清 .

　　花椰菜品种真实性鉴定 SSR分子标记法

　　1 范围

　　本文件规定了利用简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记法进行花椰菜(Brassica olG eracea L.var. botrytis L.) 品种真实性检测的术语和定义 ,缩略语 ,原理 ,检测方案 ,仪器设备 、试剂和溶液配制 ,检测程序 ,鉴定意见和结果报告。

　　本文件适用于花椰菜品种真实性验证和品种真实性身份鉴定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ,注日期的引用文件 ,仅

　　该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB/T 3543 .1 农作物种子检验规程 第 1 部分 :总则

　　GB/T 3543 .2 农作物种子检验规程 第 2 部分 :扦样

　　GB/T 3543 .5 农作物种子检验规程 第 5 部分 : 品种质量 品种纯度鉴定

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 .1

　　品种真实性验证 varietygenuinenessverification

　　通过与其对应品种名称的标准样品比较 ,检测证实送验样品与其标注的名称是否相符。

　　3 .2

　　品种真实性身份鉴定 varietygenuinenessidentification

　　经 SSR分子标记检测并通过已知品种 SSR指纹数据比对平台筛查 ,确定供检样品的真实品种名称。 3 .3

　　标准样品 standard sample

　　国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物样品或 DNA样品。

　　3 .4

　　参照样品 referencesample

　　携带 SSR位点上主要等位变异的品种 ,用于辅助确定试验样品的等位变异 ,校正仪器设备的系统误差。 3 .5

　　引物组合 primerpanel

　　具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同 、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记引物。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　bp:碱基对(base pair)

　　CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy_ribonucleoside triphosphate)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)

　　PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)

　　SSR:简单序列重复(simple sequence repeat)

　　Taq酶 :耐热 DNA聚合酶(Taq_DNA polymerase)

　　TBE:三羟甲基氨基甲烷__硼酸盐__乙二胺四乙酸(Tris_Borate_EDTA)

　　Tris:三羟甲基氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)aminomethane]

　　5 原理

　　花椰菜不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR) 的重复次数差异。 这种差异可以从抽取有代表性的试验样品中提取 DNA,用 SSR 引物进行扩增和电泳检测 ,从而利用扩增片段大小不同而区分品种。

　　依据 SSR标记检测原理 ,采用 SSR 引物 ,通过与标准样品 SSR 指纹数据比对或筛查的方式 ,对品种

　　真实性进行验证或身份鉴定。 品种真实性验证依据 SSR位点差异数目而判定 , 品种真实性身份鉴定依据

　　被检 SSR位点无差异原则进行筛查 、鉴定。

　　6 检测方案

　　6 .1 总则

　　据“”原,,统、、能,, 、、能、,制。

　　应的检测方案。

　　在严格控制条件下 ,合成选择的引物 ,按照确定的检测平台对供检样品按 DNA 提取 、PCR 扩增 、电泳 、数据分析的程序进行检测。

　　按规定要求填报检测结果 ,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。

　　DNA提取 、PCR扩增和电泳的技术条件要求 ,在适于检测 目 的和不影响检测质量的前提下 ,按照检测平台的要求允许对本文件的规定作适宜的调整。

　　6 .2 检测平台

　　6 .2 .1 对于花椰菜品种真实性验证 ,可选择采用 PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳 ;对于真实性身份鉴

　　定 ,宜采用毛细管电泳。 如需要利用 SSR指纹数据库 ,则需要利用参照品种确定试验样品的指纹后再进

　　行真实性身份鉴定 ;或在同一电泳板上比较试验样品和标准样品 ,进行品种真实性验证。

　　6 .2 .2 对于供检样品数量较多的 ,可将组织研磨仪 、DNA 自动提取仪 、自动移液工作站 、高通量 PCR 扩增仪 、多引物组合的毛细管电泳仪进行组合 , 以提高检测的综合效率。

　　6 .3 引物

　　遴选了 23对 SSR引物作为花椰菜品种真实性验证和身份鉴定的引物 ,具体见表 1 ,引物编号为 PB01 ~ PB23 ,并据此构建了花椰菜品种的 SSR指纹数据比对平台。

　　表 1 23 对 SSR 引物信息

　　表 1 (续)

　　6 .4 样品

　　6 .4 .1 送验样品可为种子 、幼苗 、叶片等组织或器官 ,需要扦样的样品数量应符合 GB/T 3543 .2 的要求。

　　6 .4 .2 送验样品如为种子 ,质量应不低于 10 g或数量不少于 1 000 粒 ;如为幼苗 、叶片 、果实等组织或器官 ,样品应至少来自 30 个随机个体的混合样或至少 10 个随机个体的单样。

　　6 .5 检测条件

　　真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行 ,包括但不限于下列条件 :

　　a) 种子检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能 ;

　　b) 所有仪器与使用的技术相适应 ,并已经过定期维护 、验证和校准 ;

　　c) 使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材 ;

　　d) 使用校准检测结果评定的适宜参照样品 .

　　7 仪器设备、试剂和溶液配制

　　7 .1 仪器设备

　　7 .1 .1 DNA提取

　　7 .1 .1 .1 DNA提取仪器设备 .

　　7 .1 .1 .2 高速冷冻离心机 :转速 ≥12 000 r/min.

　　7 .1 .1 .3 微量移液工作站或微量移液器 .

　　7 .1 .1 .4 水浴锅或干式恒温金属浴 :20 ℃ ~ 65 ℃ .

　　7 .1 .1 .5 紫外分光光度计 :波长定点扫描 230 nm、260 nm 和 280 nm.

　　7 .1 .1 .6 组织研磨仪 .

　　7 .1 .1 .7 分析天平 :感量为 0 .01 g.

　　7 .1 .1 .8 pH 计 .

　　7 .1 .1 .9 涡旋混合器 .

　　7 .1 .1 .10 高压灭菌锅 .

　　7 .1 .2 PCR扩增

　　7 .1 .2 .1 PCR扩增仪 .

　　7 .1 .2 .2 移液器等 .

　　7 .1 .3 电泳

　　7 .1 .3 .1 变性 PAGE垂直板电泳

　　7 .1 .3 .1 .1 高压电泳仪 .

　　7 .1 .3 .1 .2 垂直板电泳槽及其配套的制胶附件 .

　　7 .1 .3 .1 .3 胶片观察灯 .

　　7 .1 .3 .1 .4 水平摇床 .

　　7 .1 .3 .1 .5 凝胶成像系统或数码相机 .

　　7 .1 .3 .1 .6 移液器等 .

　　7 .1 .3 .2 毛细管电泳

　　基因分析仪 .

　　7 .1 .4 其他器具

　　7 .1 .4 .1 微量移液器 .

　　7 .1 .4 .2 电子天平(1 / 10 000) .

　　7 .1 .4 .3 高压灭菌锅 .

　　7 .1 .4 .4 加热磁力搅拌器 .

　　7 .1 .4 .5 冰箱 .

　　7 .1 .4 .6 染色盒 .

　　7 .1 .4 .7 制冰机 .

　　7 .1 .4 .8 纯超水仪等 .

　　7 .2 试剂

　　除非另有说明 ,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。

　　7 .2 .1 DNA提取

　　7 .2 .1 .1 十六烷基三 甲 基 溴 化 铵 (cetyl triethylammonium bromide, CTAB) [C16 H33 (CH3) 3 NBr, CAS号 :57__09__0 ] 。

　　7 .2 .1 .2 SDS(C12 H25 NaSO4 ,CAS号 :151__21__3) 。

　　7 .2 .1 .3 氯仿(CHCI3 ,CAS号 :67__66__3) 。

　　7 .2 .1 .4 异戊醇(C5 H12 O,CAS号 :123__51__3) 。

　　7 .2 .1 .5 乙醇(CH3 CH2 OH ,CAS号 :64__17__5) 。

　　7 .2 .1 .6 异丙醇(C3 H8 O,CAS号 :67__63__0) 。

　　7 .2 .2 PCR扩增

　　7 .2 .2 .1 dNTPs。

　　7 .2 .2 .2 10×PCR Buffer(含 MgCl2) 。

　　7 .2 .2 .3 Taq酶 。

　　7 .2 .2 .4 ddH2 O 或者 2×Taq Mix反应混合液。

　　7 .2 .3 电泳

　　7 .2 .3 .1 变性 PAGE垂直板

　　7 .2 .3 .1 .1 丙烯酰胺(acrylamide)(C3 H5 NO,CAS号 :79__06__1) 。

　　7 .2 .3 .1 .2 N ,N_亚甲基双丙烯酰胺(N ,N,_Methylenebisacrylamide)(C7 H10 N2 O2 ,CAS号 :110__26__9) 。

　　7 .2 .3 .1 .3 尿素(Urea) (CH4 N2 O,CAS号 :57__13__6) 。

　　7 .2 .3 .1 .4 去离子甲酰胺(formamide deionized)(CH3 NO,CAS号 :75__12__7) 。

　　7 .2 .3 .1 .5 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)(C10 H14 N2 Na2 O8 ,CAS号 :139__33__3)。

　　7 .2 .3 .1 .6 溴酚蓝(bromophenolblue)(C19 H10 Br4 O5 S,CAS号 :115__39__9) 。

　　7 .2 .3 .1 .7 二甲苯青(Xylene cyanole)(C25 H27 N2 NaO7 S2 ,CAS号 :4463__44__9) 。

　　7 .2 .3 .1 .8 硼酸(Orthoboric acid) (BH3 O3 ,CAS号 :10043__35__3) 。

　　7 .2 .3 .1 .9 无水乙醇(Ethanol)(C2 H6 O,CAS号 :64__17__5) 。

　　7 .2 .3 .1 .10 亲和硅烷(binding silane) 。

　　7 .2 .3 .1 .1 1 剥离硅烷(repel silane) 。

　　7 .2 .3 .1 .12 过硫酸铵(ammonium persulfate,APS)(H8 N2 O8 S2 ,CAS号 :7727__54__0) 。

　　7 .2 .3 .1 .13 冰醋酸(acetic acid) (C2 H4 O2 ,CAS号 :64__19__7) 。

　　7 .2 .3 .1 .14 四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)(C6 H16 N2 ,CAS号 :110__18__9) 。

　　7 .2 .3 .1 .15 去离子水(deionized water) 。

　　7 .2 .3 .1 .16 硝酸银(silver nitrate)(AgNO3 ,CAS号 :7761__88__8) 。

　　7 .2 .3 .1 .17 氢氧化钠(sodium hydroxide)(NaOH ,CAS号 :1310__73__2) 。

　　7 .2 .3 .1 .18 甲醛(formaldehyde)(CH2 O,CAS号 :50__00__0) 。

　　7 .2 .3 .1 .19 DNA分子量标准。

　　7 .2 .3 .2 毛细管电泳

　　与使用的遗传分析仪型号相匹配的分离胶 、分子量内标 、去离子甲酰胺 、电泳缓冲液等。

　　7 .3 溶液配制

　　DNA提取 、PCR扩增 、电泳 、银染的溶液参照附录 A规定的要求进行配制 ,所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合 GB/T 6682 规定的一级水的要求 ,其中银染溶液配置可以使用符合三级要求

　　8 检测程序

　　8 .1 引物合成

　　引物。 选用荧光毛细管电泳 ,需要在上游 SSR 引物的 5 端标记与毛细管电泳仪发射和吸收波长相匹配的

　　8 .2 DNA提取

　　8 .2 .1 DNA提取总则

　　DNA提取方法应保证提取的 DNA质量符合 PCR 扩增的要求 ,DNA 无降解 ,溶液的紫外光吸光度

　　OD260 /OD280 宜介于 1 .8 ~ 2 .0 , OD260 /OD230 宜介于 1 .5 ~ 2 .0 。 DNA 提 取 可 参 考 8 .2 .2 、8 .2 .3 或 8 .2 .4

　　的方法 ,其他达到 PCR扩增质量要求的 DNA提取方法均适用。

　　8 .2 .2 CTAB法

　　热的 CTAB(A.1 .2)提取液 ,充分混合 , 65 ℃水浴 60 min,其间多次颠倒混匀。 每管加入等体积的氯仿/

　　涤 2 遍 ,室温自然晾干后 ,加入 TE缓冲液(A.1 .3) ,充分溶解 ,检测浓度后置于 4 ℃备用或- 20 ℃保存。

　　8 .2 .3 试剂盒法

　　选用适宜 SSR分子标记法的试剂盒 ,并经验证合格后使用。 DNA提取方法 ,按照试剂盒提供的使用

　　说明进行操作。

　　8 .2 .4 SDS法

　　取试样的 幼 苗 或 叶 片 置 于 2 .0 mL 离 心 管 , 加 液 氮 充 分 研 磨 , 每 管 加 入 700 μL 的 SDS 提 取 液

　　(A.1 .4) ,研碎。 每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24 ∶ 1)混合液 , 12 000 r/min离心 5 min。 吸取上

　　清液转移至一新管 ,加入 2 倍 体 积 预 冷 的 无 水 乙 醇 , 颠 倒 混 匀 , 12 000 r/min离 心 10 min, 弃 上 清 液 , 用

　　70%乙醇溶液洗涤 2 遍 。 自然干燥后 , 加入 TE 缓 冲 液 (A.1 .3)充 分 溶 解 , 检 测 浓 度 后 置 于 4 ℃备 用 或

　　- 20 ℃保存。

　　8 .3 PCR扩增

　　8 .3 .1 反应体系

　　PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表 2 进行配制 ,可依据试验条件不同作相应调整。

　　如果使用 Mix混合反应液 ,依据说明书进行操作。

　　表 2 PCR扩增反应体系

　　8 .3 .2 反应程序

　　反应程序的反应参数宜根据 PCR扩增仪型号 、酶 、引物等不同而作适当的调整。 通常采用下列反应

　　程序 :

　　a) 预变性 :94 ℃ 5 min;

　　b) 扩增 :94 ℃变性 40 s,55 ℃退火 35 s,72 ℃延伸 45 s,进行 35 次循环 ;

　　c) 终延伸 :72 ℃ ,10 min。

　　形成的扩增产物于 4 ℃保存。

　　8 .4 扩增产物分离

　　8 .4 .1 变性 PAGE垂直板电泳

　　8 .4 .1 .1 制胶

　　硅烷工作液(A.3 .1) ,短板上涂 0 .5 mL疏水硅烷工作液(A.3 .2) 。操作过程中 防 止 两 块 玻 璃 板 互 相 污

　　灌胶。 灌胶过程中防止出现气泡。 待胶液充满玻璃板夹层 ,将 0 .4 mm 厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插

　　干净备用。

　　8 .4 .1 .2 变性

　　取 10 μL扩增产物(见 8 .3 .2) , 加 入 2 μL 6 ×加 样 缓 冲 液 (A.3 .5) , 混 匀。 在 PCR 扩 增 仪 上 运 行

　　95 ℃变性 5 min,取出立即置于冰上 ,冷却 10 min以上备用。

　　8 .4 .1 .3 电泳

　　将胶板安装于电泳槽上 , 向上槽中加入 1 × TBE缓冲液 ,使其超过凝胶 顶 部 约 3 cm , 向 下 槽 中 加 入

　　800 mL 1×TBE缓冲液(A.3 .7) 。在 60 W 恒功率下 ,预电泳 30 min。 清除加样槽内的气泡和杂质。 将

　　扩增产物预期片段大小范围(见附录 C)加以确定。

　　8 .4 .1 .4 染色

　　将附着凝胶的长玻璃板放入固定液(A.4 .1) 中 , 轻摇 3 min;用双蒸水快速漂洗 ,再取出放入染色液(A.4 .2) 中轻摇 5 min;从染色液中取出后用双蒸水快速漂洗 ,放入预冷的显影液(A.4 .3) 中轻摇至条带清晰 ,再迅速放入固定液中定影 5 min,取出后在双蒸水中漂洗 1 min;将胶板沥干后 ,进行扫描或拍照。

　　注 : 固定液 、染色液 、双蒸水和显影液的用量 ,可依据胶板数量和大小调整 , 以淹没过胶面为准。

　　8 .4 .2 荧光毛细管电泳

　　8 .4 .2 .1 根据 SSR分子标记扩增片段大小的不同 , 可以根据不同仪器选用多个引物组合进行电泳。 按

　　8 .4 .2 .2 打开 DNA分析仪 ,检查仪器工作状态和试剂状态。

　　8 .4 .2 .3 将装有样品的微孔板放置于样品架基座上 , 打开数据采集软件 ,按照 DNA 分析仪使用手册进行操作。 DNA分析仪将自动运行参数 ,并保存电泳原始数据文件。

　　注 :DNA分析仪使用参照说明书。

　　8 .5 数据分析与记录

　　8 .5 .1 总则

　　8 .5 .1 .1 电泳结果按照规定程序进行数据分析。 在引物等位基因片段大小范围内(等位基因扩增片段长度范围见附录 C 中的表 C.1) ,对于毛细管电泳 ,特异峰呈现为稳定的尖锐峰型 ,纯合位点显示为单峰 ,杂合位点显示为双峰或多峰 ;对于 PAGE垂直板电泳 ,纯合位点显示为单带 ,杂合位点显示为双带或多带。

　　8 .5 .1 .2 对于毛细管电泳 ,按照以峰高为主 、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别 、过滤处置(根据作物特点) :

　　a) 对于连带(pull_up)峰 , 即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光峰值升高的 ,应预先将其干扰消除后再进行分析 ;

　　b) 对于(n+1)峰 , 即同一位置出现两个相距 1 bp左右的峰 ,应视为单峰 ;

　　c) 对于连续多峰 , 即峰高递增或峰高接近的相差一个重复序列的连续多个峰 ,应视为单峰 ,取其最右边的峰 ,峰高值为连续多个峰的叠加值。

　　8 .5 .1 .3 对于变性 PAGE垂直板电泳 ,位于其相应的等位变异扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特异性扩增带还是新增的稀有等位变异。 采用单个个体 DNA 扩增的产物 , 出现 3 种及 3 种以上的谱带则存在非特异性扩增 ;采用混合样检测的 ,某位点出现 3 种以上的谱带或特征谱带上下有弱带等情况出现时 ,则需要单个个体进行甄别。

　　8 .5 .1 .4 采用混合样检测 ,无论是毛细管电泳还是变性 PAGE垂直板电泳 ,检测结果在某些位点出现异质性时 ,采用个体检测 ,试样至少含有 30 个个体。 异质性严重时 ,可终止真实性鉴定。

　　8 .5 .2 数据分析和读取

　　8 .5 .2 .1 变性 PAGE垂直板电泳

　　对甄别后的特异谱带进行扩增片段大小的读取 ,统一采用两段式数据记录方式。 纯合位点数据记录为 X/X ,非纯合位点数据记录为 X/Y(其中 X、Y 分别为该位点 2 个等位基因扩增片段大小) ,小片段数据在前 ,大片段数据在后。 缺失位点数据记录为 0/0。

　　8 .5 .2 .2 毛细管电泳

　　导出电泳原始数据文件 ,采用数据分析软件对数据进行甄别。

　　a) 设置参数 :在数据分析软件中预先设置好 panel、分子量内标 、panel的相应引物的 Bin(等位变异片段大小范围区间)。

　　b) 导入原始数据文件 :将电泳原始数据文件导入分析软件 ,选择 panel、分子量内标 、Bin、质量控制参数等进行分析。

　　c) 甄别过滤处置数据 :执行 8 .5 .1 的规定。

　　数据比对采用 8 .5 .3 .1 、8 .5 .3 .2 方式的 ,应通过参照样品校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩

　　增片段大小。 甄别后的特异峰落入 Bin范围内 ,直接读取扩增片段大小 ;若其峰大多不在 Bin范围内 , 可

　　将其整体平移尽量使峰落入 Bin设置范围内后读取数据。

　　8 .5 .3 数据比对

　　8 .5 .3 .1 采用与标准样品比较的 ,对甄别后的特异谱带(见 8 .5 .2 .1)或特异峰(见 8 .5 .2 .2) ,按照在同一电泳板上的检测样品与标准样品逐个位点进行两两比较 ,确定其位点差异。

　　8 .5 .3 .2 采用毛细管电泳与 SSR指纹数据比对平台比对的 ,按照数据导入模板的要求 ,将数据及其指纹截图上传到 SSR指纹数据比对平台 ,进行逐个位点在线比对 ,核实确定指纹数据的异同。

　　8 .5 .3 .3 采用 PAGE垂直板电泳与 SSR指纹数据比对平台比对的 ,用参照样品进行等位变异赋值 ,依据导入模板的数据格式进行规范 ,将数据上传到 SSR指纹数据比对平台 ,进行逐个位点的两两比对 ,核实确定指纹数据的异同。

　　注 :采用 PAGE 电泳与 SSR指纹数据比对平台比对较为困难 ,建议作为参考使用 , 比对前采取以下措施 :

　　a) 读取扩增产物片段大小数据的 ,检测样品与参照样品(引物分组方案见附录 B)同时在同一电泳板上电泳 ;

　　b) 电泳时间足够 ;

　　c) 检测样品存在扩增片段差异较小的 ,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取。

　　8 .5 .4 数据记录

　　数据比对后 ,按照位点存在差异或完全相同 、数据缺失 、无法判定等情形 ,记录每个引物的位点状况。

　　9 鉴定意见

　　9 .1 检验结果用试验样品和标准样品比较的位点差异数表示。 根据检验结果进行鉴定意见判断 ,一般分

　　GB/T 3543 .5 的规定进行田间小区种植鉴定。

　　9 .2 鉴定意见可参考以下原则 :

　　a) 试验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数大于 2 ,排除两者为同一品种。

　　b) 试验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为 1 或 2 ,不确定两者为同一品种。

　　c) 试验样品与标准样品或 SSR指纹数据平台某品种比较检测出差异位点数为 0 ,不排除两者属于同一品种。

　　10 结果报告

　　10 .1 按照 GB/T 3543 .1 的检验报告要求 ,对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报。

　　10 .2 对于品种真实性验证 ,采用下列方式进行填报 :

　　通过 对 引 物 , 采 用 电 泳 方 法 进 行 检 测 , 与 标 准 样 品 比 较 检 测 出 差 异 位 点 数 为 个 ,差异位点的引物编号为 ,鉴定意见为 : 。

　　10 .3 对于品种真实性身份鉴定 ,采用下列方式进行填报 :

　　a) 通过 对引物 , 采用 电泳方法进行检测 , 经与 SSR 指纹 数 据 筛 查 , 供 检 样 品 与 品种未检测出位点差异 ,鉴定意见为 : 。

　　b) 通过 对引物 ,采用 电泳方法进行检测 ,经与 SSR 指纹数据筛查 ,检测到供检样品与品种位点差异为 1 或 2 ,鉴定意见为 : 。

　　c) 通过 对引物 ,采用 电泳方法进行检测 ,经与 SSR 指纹数据筛查 ,未检测到与供检样品位点一致品种 ,无法鉴定品种身份。

　　10 .4 属于下列情形之一的 ,应在检验报告中注明 :

　　a) 送检样品低于 6 .4 .1 规定的数量 ;

　　b) 与试验样品比较的标准样品的来源 ;

　　c) 与 SSR指纹数据库进行数据比对 ;

　　d) 试验品种异质性严重的位点(引物编号)清单 ;

　　e) 检测采用其他 SSR 引物的名称及序列。

　　附 录 A

　　(资料性)

　　溶 液 配 制

　　A.1 DNA提取

　　A.1 .1 0 .5 mol/L EDTA 溶液

　　Na2 EDTA.2H2 O 186 .1 g溶于 800 mL水中 ,加固体 NaOH 调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 1 000 mL,高压灭菌。

　　A.1 .2 CTAB提取液

　　固体 NaCl81 .7 g、CTAB 20 .0 g、1 mol/LTris_HCl100 mL和 0 .5 mol/LEDTA 40 mL,加水定容至 1 000 mL,高压灭菌 ,4 ℃储存。

　　A.1 .3 TE 缓冲液

　　1 mol/LTris_HCl5 mL和 0 .5 mol/LEDTA 1 mL,加 HCl调 pH 至 8 .0 ,加水定容至 500 mL,高压灭菌 ,4 ℃储存。

　　A.1 .4 SDS提取液

　　1 mol/LTris_HCl50 mL、0 .5 mol/LEDTA 40 mL、5 mol/L NaCl50 mL和 SDS7 .5 g,加水定容至500 mL,高压灭菌 ,4 ℃储存。

　　A.2 PCR扩增

　　A.2 .1 dNTP

　　存,用。120 μLTE缓冲液定 容 , 配 制 成 每 种 核 苷 酸 终 浓 度 为 10 mmol/L 的 工 作 液。 高 压 灭 菌 , - 20 ℃

　　A.2 .2 SSR 引物

　　用 TE缓冲液分别配制正向引物和反向引物至浓度为 5 μmol/L的工作液。

　　A.2 .3 25 mmol/L氯化镁(MgCl2)溶液

　　固体 MgCl2 1 .19 g,加水定容至 500 mL。高压灭菌 , - 20 ℃保存。

　　A.3 制胶和电泳

　　A.3 .1 亲和硅烷工作液

　　量取 93 mL 的 75%乙醇 、5 mL 的 冰 醋 酸 和 2 mL 的 亲 和 硅 烷 原 液 , 混 匀 , 于 常 温 避 光 干 燥 处 保 存备用。

　　A.3 .2 疏水硅烷工作液

　　量取 25 mL 的二甲基二氯硅烷 、75 mL 的三氯甲烷混匀 ,于常温避光干燥处保存备用。

　　A.3 .3 6 .0%聚丙烯酰胺凝胶

　　尿素 420 .0 g、丙烯酰胺 57 g、甲叉丙烯酰胺 3 g溶于水中 ,加入 10×TBE缓冲液 50 mL加水定容至1 000 mL。

　　A.3 .4 10%过硫酸铵溶液

　　0 .1 g过硫酸铵溶于 1 mL超纯水中 ,4 ℃备用。

　　A.3 .5 6×加样缓冲液

　　去离子甲酰胺 49 mL、0 .5 mol/L EDTA 1 mL、溴酚蓝 0 .125 g 和二甲苯青 FF 0 .125 g混合。

　　A.3 .6 10 × TBE 缓冲液

　　Tris碱 108 .0 g、硼酸 55 .0 g 和 0 .5 mol/L EDTA 37 mL,加水定容至 1 000 mL。 A.3 .7 1 × TBE 缓冲液

　　10×TBE缓冲液 500 mL,加水定容至 5 000 mL。

　　A.3 .8 6×溴酚蓝 二甲苯青电泳指示剂

　　溴酚蓝 0 .25 g、二甲苯青 FF 0 .25 g 和蔗糖 40 .0 g,加水定容至 100 mL。 A.4 银染溶液

　　A.4 .1 固定液

　　量取 200 mL无水乙醇 、10 mL冰醋酸 ,加水定容至 2 000 mL。

　　A.4 .2 染色液

　　硝酸银 1 .0 g,加水定容至 500 mL。

　　A.4 .3 显影液

　　固体 NaOH 15 g 和甲醛 5 mL,加水定容至 1 000 mL。

　　附 录 B (资料性)

　　引物分组信息

　　23 对 SSR 引物标记四色荧光的引物分组方案见表 B.1 。

　　表 B.1 23 对 SSR 引物标记四色荧光的引物分组方案

　　附 录 C

　　(资料性)

　　标记荧光的引物信息

　　表 C.1 列出了 23 对引物的信息以及引物在已知花椰菜品种中扩增的片段长度范围 、主要等位基因扩增片段大小和参照样品。

　　表 C.1 已知品种主要等位基因扩增片段信息

　　表 C.1 (续)

　　附 录 D

　　(资料性)

　　参照样品及其等位变异信息

　　参照样品及其等位变异信息见表 D.1 .

　　表 D.1 参照样品及其等位变异信息

　　单位为碱基对