SC/T 7251-2025 鱊头槽绦虫病诊断方法

　　中华人民共和国水产行业标准

　　SC/T 7251—2025

　　头槽绦虫病诊断方法

　　Diagnostic methods for Schyzocotyle acheilognathi disease

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

　　本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出。

　　本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC 156/SC 11)归 口 。本文件起草单位 : 中国科学院水生生物研究所 、全国水产技术推广总站 、中国水产科学研究院淡水渔

　　业研究中心。

　　本文件主要起草人 :李文祥 、王桂堂 、张翔 、郭传波 、邹红 、李明 、习丙文。

　　头槽绦虫病诊断方法

　　1 范围

　　本文件描述了头槽绦虫(Schyzocotyle acheilognathi)病诊断的试剂和材料 、仪器设备 、临床症状 、样品 , 以及形态学鉴定 、PCR检测和综合判定的方法。

　　本文件适用于头槽绦虫病的诊断 、监测和流行病学调查。

　　2 规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3 术语和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3 .1

　　寄生虫 parasite

　　寄生于水生动物的病原 ,包括原虫 、蠕虫和甲壳类等。

　　[来源 :SC/T 7011 .1—2021 ,3 .2 .4 .2] 3 .2

　　寄生虫病 parasitosis

　　寄生虫侵入水生动物而引起的疾病。

　　[来源 :SC/T 7011 .1—2021 ,3 .2 .4 .3] 3 .3

　　绦虫病 cestodiasis

　　由绦虫侵入鱼体而引起的寄生虫病。

　　4 缩略语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

　　dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy_ribonucleoside triphosphate mixture)

　　EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)

　　PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

　　rDNA_ITS:核糖体 DNA 的内转录间隔区(ribonsomalDNA_internaltranscribed spacer)

　　TAE:Tris_Acetate_EDTA 缓冲溶液

　　Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus)

　　TE:Tris盐酸和 EDTA 缓冲溶液(EDTA Tris . HCl)

　　Tris_HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸[Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride]

　　5 试剂和材料

　　除非另有说明 ,在分析中仅适用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

　　5 .1 无水乙醇 :常温保存。

　　5 .2 二甲苯 :常温保存。

　　5 .3 加拿大树胶 :常温保存。

　　5 .4 Taq DNA 聚合酶 : - 20 ℃保存 ,避免反复冻融。

　　5 .5 dNTPs(2 .5 mmol/L) :含 dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各 2 .5 mmol/L。

　　5 .6 上游引物 :5 ,_GTCGTAACAAGGTTTCCGTA_3 ,;

　　下游引物 :5 ,_TATGCTTAA(G/A)TTCAGCGGGT_3 ,。

　　5 .7 DNA marker:200 bp~ 2 000 bp, - 20 ℃保存。

　　5 .8 核酸染料 : - 20 ℃保存。

　　5 .9 0 .7%生理盐水 :按附录 A 中 A.1 的要求配制。

　　5 .10 4%甲醛溶液 :按 A.2 的要求配制。

　　5 .1 1 高氏洋红液 :按 A.3 的要求配制。

　　5 .12 裂解缓冲液 :按 A.4 的要求配制。

　　5 .13 50×TAE 电泳缓冲液 :按 A.5 的要求配制。

　　5 .14 1 ×TAE 电泳缓冲液 :按 A.6 的要求配制。

　　5 .15 DNA抽提缓冲液 1 :按 A.7 的要求配制。

　　5 .16 DNA抽提缓冲液 2 :按 A.8 的要求配制。

　　5 .17 TE缓冲液 :按 A.9 的要求配制。

　　5 .18 琼脂糖凝胶(1%) :按 A.10 的要求配制。

　　5 .19 阴性对照 :不含头槽绦虫的鱼体组织 DNA, - 20 ℃保存。

　　5 .20 阳性对照 :头槽绦虫 DNA, - 20 ℃保存。

　　6 仪器设备

　　6 .1 体视显微镜。

　　6 .2 普通光学显微镜。

　　6 .3 高速冷冻离心机 :最高转速 10 000 g 以上 ,温度 4 ℃ 。

　　6 .4 普通冰箱 :具 4 ℃冷藏室和- 20 ℃冷冻室。

　　6 .5 PCR扩增仪。

　　6 .6 水平电泳系统。

　　6 .7 凝胶成像系统。

　　7 临床症状

　　病鱼体色发黑 ,身体消瘦 ,食欲下降 ;典型症状是口常张开 ,病鱼拒食 ,腹部前端膨胀 ,剖开腹腔 ,可见前肠有胃囊状凸起 ;剖检肠道可见乳白色的扁平带状虫体。

　　8 样品

　　8 .1 采样对象

　　采集具有典型临床症状的鱼。

　　8 .2 采样数量

　　每一采样批次根据鱼的大小取 10 尾 ~ 20 尾 。

　　8 .3 鱼样品保存及运输

　　鱼样品宜活体运输到实验室 ,冰鲜样品 4 ℃保藏 ,24 h 内运输到实验室 ,立即取样检测。

　　8 .4 采样部位

　　剖开样品鱼的腹腔 ,剪取整个肠道。

　　8 .5 绦虫样品采集与保存

　　用剪刀剪开肠壁 ,用镊子轻轻挑出虫体 ,避免拉断头部 ,放在盛有 0 .7%生理盐水(5 .9) 的培养皿中 ,

　　冲洗干净。 一部分绦虫样 品 用 于 活 体 观 察 和 标 本 制 作 , 或 用 4% 甲 醛 溶 液 (5 .10) 固 定 , 24 h 后 , 保 存 在

　　80%乙醇中。

　　另一部分绦虫样品用于分子鉴定 ,用无水乙醇固定 ,4 ℃保存。

　　9 形态学鉴定

　　9 .1 绦虫标本制作

　　将 80%乙醇保存的绦虫样品进行复水 ,按照 70%乙醇→ 50%乙醇→ 30%乙醇→ 10%乙醇→ 蒸馏水进

　　行 ,每一阶段约 15 min;新鲜绦虫样品可直接进行染色。

　　将复水或新鲜的绦虫样品置于高氏洋红液(5 .11) 中 ,染色 10 h后 ,用自来水冲洗 2 h。

　　脱水和透明按照 10%乙醇→ 30%乙醇 → 50%乙醇 → 70%乙醇 → 80%乙醇 → 90%乙醇 → 95%乙醇 → 100%乙醇→ 100%乙醇→ 100%乙醇+二甲苯(1 ∶ 1) → 二甲苯进行透明 ,每一阶段约 15 min。

　　用镊子将透明后的虫体迅速放入载玻片上的加拿大树胶(5 .3) 圆滴中 ,用解剖针将虫体标本拨正 ,盖上盖玻片 ,干燥。

　　9 .2 形态学观察

　　将盛有生理盐水和新鲜绦虫样品的培养皿置于体视显微镜下(6 .1) ,调节放大倍数和焦距 ,观察绦虫头节和体节形态。

　　染色标本则置于普通光学显微镜下(6 .2) ,观察头节形态 , 以及成熟节片的雌 、雄性生殖器的位置 、形态 、大小。

　　9 .3 结果判定

　　虫体扁带形 , 由多节片组成 ,头节略呈心形 ,两侧各有 1 个深沟槽(见附录 B 中的图 B.1) 。 每个成熟节片内精巢小球形 ,排列在髓部 ;卵黄腺散布在皮质部 , 比精巢小 ;卵巢双叶 ,横列在节片后端的中央处 ;子宫呈 S形 ,开口于节片中央腹面(见图 B.2) 。

　　如果虫体符合该形态学特征 ,判定形态学鉴定结果为阳性。

　　10 PCR检测

　　10 .1 虫体 DNA 的提取与保存

　　将无水乙醇固定的绦虫剪取一个体节 ,充分干燥去除乙醇 ,置入 1 .5 mL 的离心管中 ,加入 500 μL裂

　　解缓冲液(5 .12)于 55 ℃消化 3 h。冷却至室温后加入 500 μL DNA抽提缓冲液 1 (5 .15) ,冰上摇匀 ,静置

　　2 (5 .16) ,冰上摇匀 ,静置 10 min;1 000 g,4 ℃离心 10 min,取上清液。

　　洗涤 ,, 醇缓,下(5 170)0,(n弃)。上清液;70%乙醇

　　10 .2 rDNAG ITS的 PCR扩增

　　25 μL的 PCR反应体系包括 :1 μL模板基因组 DNA(10 ng~ 50 ng) 、1 μL的上游引物和 1 μL的下游引物(10 μmol/L)(5 .6) 、2 μL的 dNTPs(0 .2 mmol/L) 、2 .5 μL 的 MgCl2 (2 mmol/L) 、0 .5 μL的 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)(5 .4)和 2 .5 μLTaq DNA 聚合酶缓冲液 ,最后加灭菌水 14 .5 μL。

　　PCR反应条件 :94 ℃预变性 3 min,再 94 ℃ 30 s→ 56 ℃ 30 s→ 72 ℃ 60 s,共 35 个循环 ; 72 ℃延伸10 min,最后 4 ℃保温。

　　PCR扩增时应设置阴性对照(5 .19)和阳性对照(5 .20) 。

　　10 .3 PCR产物电泳与测序

　　取 5 μLPCR产物 ,用 1% 琼脂糖凝胶(5 .18)(含终浓度为 0 .05 μL/mL核酸染料)于 1 × TAE 电泳缓冲溶液(5 .14) 中 , 在 水 平 电 泳 系 统 (6 .6) 5 V/cm 电 压 下 电 泳 约 0 .5 h 进 行 分 离。 同 时 , 设 置 DNA

　　marker(5 .7)作为参照 ,凝胶成像系统(6 .7)检查并拍照记录。 如果观察到大约 1 400 bp大小扩增片段 ,

　　则对 PCR扩增产物进行测序。

　　10 .4 结果判定

　　10 .4 .1 检测成立的条件

　　阳性对照在 1 400 bp处有条带 , 阴性对照在 1 400 bp处无条带 ,检测有效。

　　10 .4 .2 PCR检测结果判定

　　将检测样品所测定的 rDNA_ITS序列与附录 C 中的参考序列进行比对分析 , 当相似性在 97 .0%以上者 ,判定 PCR检测结果为阳性。

　　1 1 综合判定

　　1 1 .1 疑似病例判定

　　如果病鱼临床症状符合第 7 章的描述 ,则判定为疑似头槽绦虫病。

　　1 1 .2 确诊病例判定

　　如果病鱼疑似患头槽绦虫病 ,形态学鉴定结果或 PCR检测结果为阳性 ,则判定结果为阳性。

　　如果病鱼疑似患头槽绦虫病 ,形态学鉴定结果为阴性 ,则判定结果为阴性。

　　附 录 A

　　(规范性)

　　试剂及其配制

　　A.1 0 .7%生理盐水

　　称取 0 .7 g NaCl,加入去离子水定容至 100 mL。

　　A.2 4% 甲醛溶液

　　去离子水与甲醛(40%)按 9 ∶ 1 混合配置 ,室温保存。

　　A.3 高氏洋红液

　　洋红 2 g,钾明矾(十二水合硫酸铝钾)6 g,冰醋酸 25 mL,去离子水 100 mL。将钾明矾 、洋红放入蒸馏水中共煮 ,搅拌 ,使全溶 ,冷却后置于有色瓶中放于窗口暴晒 10 d,加冰醋酸后过滤 ,封存 ,4 ℃保存 ,使用时稀释至 1%的洋红溶液。

　　A.4 裂解缓冲液

　　900 μLTE缓冲液 、80 μL蛋白酶 K(5 mg/mL)和 20 μL10% SDS的混合溶液。

　　A.5 50×TAE 电泳缓冲液(50 倍)

　　242 .0 gTris碱 、37 .2 g Na2 EDTA . 2H2 O 混合 ,然后加入 800 mL 的去离子水充分搅拌溶解 ,再加入 57 .1 mL 的冰乙酸充分混匀 ,最后加入去离子水定容至 1 L,室温保存。

　　A.6 1 × TAE 电泳缓冲液

　　量取 20 mL 的 50×TAE 电泳缓冲液 ,加入去离子水定容至 1 000 mL,室温保存。

　　A.7 DNA抽提缓冲液 1

　　苯酚 、氯仿(三氯甲烷) 、异戊醇以 25 ∶ 24 ∶ 1 的体积比混合 ,密闭避光 ,4 ℃保存。

　　A.8 DNA抽提缓冲液 2

　　氯仿与异戊醇以 24 ∶ 1 的体积比混合 ,密闭避光 ,4 ℃保存

　　A.9 TE 缓冲液

　　1 mL Tris_HCl(1 mol/L, pH 8 .0)和 0 .2 mLEDTA(0 .5 mol/L, pH 8 .0)混合 ,加去离子水定容至100 mL,高压蒸汽灭菌后 ,4 ℃保存。

　　A.10 琼脂糖凝胶( 1 % )

　　称取 1 g琼脂糖粉 ,加入 100 mL 1 × TAE 电 泳 缓 冲 液 , 加 热 融 化。 待 温 度 降 至 60 ℃左 右 时 , 加 入

　　5 μL核酸染料 ,均匀铺板 ,厚度为 3 mm~ 5 mm。

　　附 录 B

　　(资料性)

　　头槽绦虫病

　　B.1 病原

　　头槽绦虫病的病原是头槽绦虫 ,虫体带状 ,体长 2 cm~ 25 cm ,头节呈心形 ,两侧有 2 个较深的沟

　　道 ,可感染多种淡水鱼类 ,但对养殖鱼类危害最大的是草鱼。 该绦虫在 2 龄及以下的草鱼苗种中有较高的

　　感染率 ,会导致鱼体瘦弱 ,体色发黑 ,离群独游 , 口常张开 ,但不摄食 ,又称 “干口病 ”, 常引起草鱼苗种的大

　　量死亡。 另外 ,该绦虫可寄生其他野生鱼类 ,夺取鱼类营养 ,影响生长 ,从而影响鱼类种群增长。 该绦虫呈

　　世界性分布 ,在亚洲 、美洲 、欧洲 、非洲的多个国家的多种鱼类中都有发现。

　　B.2 易感宿主

　　头槽绦虫可感染草鱼(Ctenopharyngodonidella) 、鲫 (Carassiusauratus) 、鲤 (Cyprinuscarpio) 、

　　马口鱼(Opsariichthysbidens) 、赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus) 、红鳍原鲌(CultrichthyserythropterG

　　us) 、乌鳢(Channaargus)等鱼类。 在我国的养殖鱼类中 ,草鱼是主要的易感宿主 ,且在 2 龄及以下苗种中

　　最常见。

　　B.3 头槽绦虫形态特征

　　头槽绦虫的头节形态特征见图 B.1 , 成熟节片见图 B.2 。

　　2

　　a) 体视显微镜下的新鲜标本 b) 染色标本标引序号说明 :

　　1 — 心形头节 ;

　　2 — 头节两侧的沟槽。

　　图 B.1 头槽绦虫的头节

　　标引序号说明 :

　　1 — 卵黄腺 ;

　　2 — 精巢 ;

　　3 — 子宫 ;

　　4 — 卵巢。

　　图 B.2 头槽绦虫成熟节片

　　附 录 C

　　(资料性)

　　头槽绦虫核糖体 DNA 内转录间隔区(ITS)扩增产物的参考序列(GenBank登录号 :KY71 1 164 .1 )

　　参 考 文 献

　　[1 ] SC/T 7011 .1—2021

　　水生动物疾病术语与命名规则

　　第 1 部分 :水生动物疾病术语