NY/T 4782-2025 油菜籽中甾醇含量的测定 分光光度法

　　中华人民共和国农业行业标准

　　NY/T 4782—2025

　　油菜籽中甾醇含量的测定 分光光度法

　　Determination of sterol content in rapeseed—

　　Spectrophotometric method

　　2025-12-09 发布

　　2026-05-01 实施

　　中华人民共和国农业农村部 发 布

　　前 言

　　本文件按照 GB/T 1 .1—2020« 标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则»的规定起草 .

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利 . 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 .

　　本文件由农业农村部种植业管理司提出并归 口 .

　　本文件起草单位 : 中国农业科学院油料作物研究所 、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室(武汉) 、农业农村部油料及制品质量检验测试中心 .

　　本文件主要起草人 :李培武 、王督 、张良晓 、马飞 、汪雪芳 、张文 、喻理 、白艺珍 、姜俊 .

　　油菜籽中甾醇含量的测定 分光光度法

　　1 范围

　　本文件描述了采用分光光度法测定油菜籽中甾醇含量的原理 、试剂和材料 、仪器和设备 、分析步骤和结果计算 .

　　本文件适用于油菜籽中甾醇含量的测定 .

　　本文件甾醇检测线性范围为 1 000 mg/kg~ 8 000 mg/kg.

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 . 其中 ,注日期的引用文件 ,仅该日期对应的版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本文件 .

　　GB 5491 粮食 、油料检验 扦样 、分样法

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　3 术语和定义

　　本文件没有需要界定的术语和定义 .

　　4 原理

　　试样用氢氧化钾 乙醇溶液皂化 ,经液液萃取得到甾醇溶液 , 与氧化酶溶液和显色液反应生成有色产物 ,在波长 450 nm 处有特征吸收 ,其吸光度值与甾醇含量成正比 .

　　5 试剂和材料

　　除非另有说明 ,本方法所用试剂为分析纯 ,实验室用水符合 GB/T 6682 中二级水的规定 .

　　5 .1 试剂

　　5 .1 .1 正己烷(C6 H14 ,CAS号 :110G 54G3) .

　　5 .1 .2 二甲基亚砜[(CH3) 2 SO,CAS号 :67G 68G 5] .

　　5 .1 .3 乙醇(C2 H6 O,CAS号 :64G 17G 5) .

　　5 .1 .4 氢氧化钾(KOH ,CAS号 :1310G 58G3) .

　　5 .1 .5 胆固醇氧化酶(CAS号 :9028G 76G 6) :纯度 >10 U/mg, - 20 ℃保存 .

　　5 .1 .6 蔗糖(C12 H22 O11 ,CAS号 :57G 50G 1) .

　　5 .1 .7 牛血清白蛋白(CAS号 :9048G46G8) .

　　5 .1 .8 柠檬酸(C? H? O? ,CAS号 :77G 92G 9) .

　　5 .1 .9 磷酸氢二钠(Na2 HPO4 ,CAS号 :7558G 79G4) .

　　5 .1 .10 四甲基联苯胺(C16 H20 N2 ,CAS号 :54827G 17G 7) .

　　5 .1 .1 1 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG:浓度 :1 mg/mL,工作效价 1 ∶ 5 000 ~ 1 ∶ 7 500 ,4 ℃保存 .

　　5 .2 试剂配制

　　5 .2 .1 样品提取液 :称取 12 .0 g氢氧化钾(5 .1 .4)于 10 mL水中 ,用乙醇(5 .1 .3)定容至 100 mL,溶液应呈无色或淡黄色 .

　　5 .2 .2 样品稀释液 :二甲基亚砜 乙醇(4 ∶ 1 ,V/V)混合溶液 .

　　5 .2 .3 缓冲液 :取 2 .0 g蔗糖(5 .1 .6)和 0 .5 g 牛血清白蛋白(5 .1 .7)溶解于 100 mL水中 ,现配现用 .

　　5 .2 .4 氧化酶溶液 :取 1 kU 胆固醇氧化酶(5 .1 .5) 、32 μL辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG (5 .1 .11)溶解于 40 mL缓冲液(5 .2 .3) ,现配现用 .

　　5 .2 .5 显色液 :称取 5 .0 mg 四甲基联苯胺(5 .1 .10)溶解于 2 .5 mL 乙醇(5 .1 .3) 中 ,再加入 37 .32 g 柠檬酸(5 .1 .8) 、73 .64 g磷酸氢二钠(5 .1 .9)用水定容至 2 000 mL,现配现用 .

　　5 .3 标准品

　　βG谷甾醇(βGSitosterol,CAS号 :83G46G 5) ,纯度 ≥95% .

　　5 .4 标准溶液配制

　　5 .4 .1 标准储备溶液

　　溶液准,在确G,.) 品 (精确至 0 .000 1 g) ,用乙醇(5 .1 .3)配制成浓度为 50 mg/mL 的标准

　　5 .4 .2 标准工作溶液

　　移取适量的标准 储 备 溶 液 (5 .4 .1) 于 5 mL 容 量 瓶 中 , 以 样 品 稀 释 液 (5 .2 .2)定 容 , 配 制 成 浓 度 为

　　1 mg/mL、2mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL和 8 mg/mL 的系列标准工作溶液 ,4 ℃保存 ,现配现用 .

　　6 仪器和设备

　　6 .1 分光光度计 :波长 450 nm ,配 1 .0 mL 比色皿 .

　　6 .2 分析天平 :感量 0 .001 g 和 0 .000 1 g.

　　6 .3 恒温箱 : (37±1)℃ .

　　6 .4 涡旋混合器 .

　　6 .5 研磨仪 :研磨管配 3 mm 钢珠 .

　　6 .6 移液器 :20 μL~ 200 μL、100 μL~ 1 000 μL.

　　6 .7 离心机 :转速 ≥4 000 r/min.

　　6 .8 分样筛 :20 目 .

　　7 分析步骤

　　7 .1 试样制备

　　按 GB 5491 的规定进行扦取和分样 ,样品粉碎至全部通过分样筛(6 .8) ,充分混合 ;

　　7 .2 试样提取

　　称取 0 .5 g试样(精确至 0 .001 g)于研磨管中 ,加入 3 mL样品提取液(5 .2 .1) ,用研磨仪(6 .5)研磨提取 3 min,冷却后将提取液全部转移至 15 mL离心管中 ,加入 2 mL水 ,混匀 ;加入 3 mL正己烷(5 .1 .1) ,涡旋混匀 ,4 000 r/min离 心 3 min, 移 取 2 mL 上 层 溶 液 , 加 入 1 mL 样 品 稀 释 液 (5 .2 .2) , 涡 旋 混 匀 , 4 000 r/min离心 3 min,移取 200 μL下层溶液到离心管中 ,待测 .

　　7 .3 标准曲线

　　分别移取 60 μL 1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL和 8 mg/mL 的标准工作液(5 .4 .2)于比色皿中 ,依次加入 100 μL氧化酶溶液(5 .2 .4)和 200 μL显色液(5 .2 .5) , 混匀 , 置于恒温箱(6 .3) 内反应3 min,在 450 nm 处测定吸光度值 , 以标准品吸光度值为纵坐标 ,标准工作溶液(5 .4 .2)浓度(mg/mL)为横坐标 ,绘制标准曲线 .

　　7 .4 测定

　　移取 60 μL待测液 ,测定同 7 .3 . 同时做试剂空白(不称取样品 ,步骤同 7 .2) ,并根据样品提取液的吸光度(扣除试剂空白吸光度)计算甾醇含量 .

　　若样品吸光度值高于标准工作溶液的吸光度值范围 ,应酌情减少称样量或将样品稀释后重新测定 .

　　8 结果计算

　　试样中甾醇含量按公式(1)计算。

　　式中 :

　　X — 试样中甾醇含量的数值 ,单位为毫克每千克(mg/kg) ;

　　c — 从标准工作曲线上得到甾醇浓度的数值 ,单位为毫克每毫升(mg/mL) ;

　　n — 试样的稀释倍数 ;

　　V — 试样测定液体积的数值 ,单位为毫升(mL) ;

　　m — 试样质量 ,单位为克(g)。

　　试样结果中甾醇含量以 β一谷甾醇计 ,计算结果以重复性条件下获得的 2 次独立测定结果的算术平均值表示 ,结果保留 4 位有效数字。

　　9 精密度

　　9 .1 重复性

　　在重复条件下 ,获得的 2 次独立测定结果的相对偏差不应超过算术平均值的 20% 。

　　9 .2 再现性

　　在再现性条件下 ,获得的 2 次独立测定结果的相对偏差不应超过算术平均值的 25% 。